本文選題：腎細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：CUL4B　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)起源于腎實(shí)質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞,其發(fā)病率高,大約90%的腎臟惡性腫瘤為RCC。隨著人們生活方式和生活環(huán)境的改變,腎癌的發(fā)病率不斷增加。據(jù)世界癌癥中心資料顯示,2015年美國(guó)預(yù)測(cè)新發(fā)的腎癌患者人數(shù)為61,560,腫瘤特異性死亡患者數(shù)目也高達(dá)14,080。我國(guó)腎癌的患病人數(shù)也逐年增加,少于膀胱癌成為泌尿男生殖系第二位腫瘤。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性RCC患者來說,免疫治療和靶向藥物治療已成為各大指南推薦的治療策略。尤其隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,越來越多的分子信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在RCC中行使著重要的功能。在此基礎(chǔ)上,美國(guó)、歐洲以及中國(guó)批準(zhǔn)了越來越多的靶向藥物用于治療晚期轉(zhuǎn)移性RCC。然而,隨著分子靶向藥物的應(yīng)用,靶向藥物的耐藥性問題嚴(yán)重影響了RCC治療的療效。因此尋找RCC發(fā)生發(fā)生進(jìn)展中新的靶點(diǎn)以及信號(hào)通路,預(yù)測(cè)RCC患者的預(yù)后,指導(dǎo)靶向藥物的選擇以及尋求靶向藥物耐藥后的解決方案已成為晚期轉(zhuǎn)移性RCC研究中亟待解決的問題。Cullins進(jìn)化上高度同源,參與構(gòu)成了最大的E3泛素連接酶,參與調(diào)控細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育等重要的生物進(jìn)程。人類基因編碼8種Cullin成員,包括CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC。CUL4B在細(xì)胞增值、DNA復(fù)制及細(xì)胞周期調(diào)控等方面行使相應(yīng)功能。X染色體上CUL4B發(fā)生突變可以造成精神發(fā)育遲滯。敲除CUL4B的小鼠在胚胎階段發(fā)生死亡。除此以外,CUL4B具有定位于細(xì)胞核的信號(hào),在細(xì)胞核里面行使相關(guān)功能。研究證實(shí)CUL4B能夠抑制miR-372和miR-373,上調(diào)CDK2的表達(dá),從而促進(jìn)DNA的復(fù)制。此外,CUL4B能夠下調(diào)抑癌基因p16、PTEN等的功能,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。因此,最近一段時(shí)間許多研究都發(fā)現(xiàn)了CUL4B在惡性腫瘤中行使相應(yīng)的功能。研究發(fā)現(xiàn)CUL4B與肝癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、骨肉瘤以及腫瘤微環(huán)境等密切相關(guān)。但是,CUL4B在泌尿系統(tǒng)的腫瘤尤其是RCC中的作用及機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。c-Met是酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK),與其特異性配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)相結(jié)合后,發(fā)生同源二聚化和磷酸化,從而發(fā)揮相應(yīng)的作用。c-Met與HGF結(jié)合后激活一系列通路,包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路以及黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)通路等。HGF/MET是調(diào)控血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等的重要信號(hào)通路。盡管c-Met在正常生理?xiàng)l件下對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)非常重要,但是c-Met突變、擴(kuò)增以及過表達(dá)等變化,造成其在人類腫瘤中異常激活。研究發(fā)現(xiàn)c-Met在腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)和乳頭狀腎細(xì)胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)中均過表達(dá)。c-Met的表達(dá)水平與RCC的病理特性以及疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。因此c-Met抑制劑如卡博替尼等作為RCC治療中的靶向藥物也紛紛進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。近期研究表明c-Met激活與惡性腫瘤分子靶向藥物治療中的耐藥問題關(guān)系密切。因此,c-Met在RCC發(fā)生發(fā)展及靶向藥物耐藥等方面具有重要研究?jī)r(jià)值,但是CUL4B對(duì)c-Met通路是否有調(diào)控作用,目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道�；谝陨涎芯勘尘�,我展開了下面的研究：首先,探討CUL4B在RCC中的表達(dá)及作用；然后,尋找CUL4B在RCC中的作用機(jī)制,通過蛋白芯片發(fā)現(xiàn)c-Met可能在CUL4B的調(diào)控中發(fā)揮重要作用；最后進(jìn)一步探討CUL4B調(diào)控c-Met通路對(duì)RCC的影響。通過本課題的研究以期發(fā)現(xiàn)RCC發(fā)生進(jìn)展中新的靶點(diǎn)和分子信號(hào)通路,從而更好地預(yù)測(cè)RCC患者的預(yù)后、指導(dǎo)靶向藥物的選擇以及尋求靶向藥物耐藥后的解決方案。第一部分CUL4B在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用已知CUL4B在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用,且表達(dá)量都升高,為進(jìn)一步探討CUL4B在RCC中是否同樣具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展的作用,本部分利用了人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系、人腎癌組織標(biāo)本以及裸鼠成瘤動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)對(duì)象,展開相應(yīng)研究。具體情況如下：1.CUL4B在RCC細(xì)胞系以及RCC組織中表達(dá)升高：細(xì)胞培養(yǎng)RCC細(xì)胞系769-P、786-0和OS-RC-2以及正常的永生化的腎小管上皮細(xì)胞系HK-2,運(yùn)用western blot的方法測(cè)定CUL4B在以上細(xì)胞系中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CUL4B在3種RCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯均高于HK-2中的表達(dá)水平。收集33例腎臟腫瘤術(shù)后,病理已證實(shí)的RCC標(biāo)本,同時(shí)收集腫瘤旁邊正常腎臟組織,同樣運(yùn)用western blot的方法檢測(cè)CUL4B在33對(duì)RCC組織和正常腎皮質(zhì)中蛋白表達(dá)水平的差異,發(fā)現(xiàn)CUL4B在其中27對(duì)(81.8%)組織中,腫瘤比瘤旁表達(dá)含量高。2. CUL4B的表達(dá)水平與RCC的分級(jí)、分期以及預(yù)后等呈正相關(guān)關(guān)系：應(yīng)用RCC的組織芯片,芯片中包含90例RCC患者的基本病理信息以及隨訪數(shù)據(jù)。采用免疫組織化學(xué)(IHC)染色的技術(shù),對(duì)CUL4B的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)RCC中CUL4B表達(dá)的總得分為組織染色強(qiáng)度評(píng)分乘以組織染色陽(yáng)性率得分。得分6分評(píng)為高表達(dá),反之為低表達(dá)。分別統(tǒng)計(jì)CUL4B高表達(dá)和低表達(dá)的人數(shù),運(yùn)用卡法檢驗(yàn)計(jì)算CUL4B的表達(dá)水平與患者年齡、性別、核分級(jí)、病理分期以及腫瘤大小的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)CUL4B的表達(dá)水平與年齡無關(guān)(P=0.278),與性別無關(guān)(P=0.876),與腫瘤核分級(jí)呈正相關(guān)(P=0.006),與病理分期呈正相關(guān)(P=0.02),與腫瘤大小無關(guān)(P=0.054)。隨后,運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析,對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CUL4B高表達(dá)患者腫瘤特異性生存率降低(P=0.031)。3. CUL4B表達(dá)水平的變化影響RCC細(xì)胞系增殖、克隆形成、侵襲及遷移等生物學(xué)行為：運(yùn)用慢病毒感染的方法成功構(gòu)建CUL4B干擾或過表達(dá)的RCC細(xì)胞系模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。應(yīng)用Western blot測(cè)定CUL4B干擾或過表達(dá)的RCC細(xì)胞已構(gòu)建成功。采用MTT來檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)CUL4B干擾的RCC細(xì)胞系(shCUL4B)較對(duì)照組(shControl)相比,細(xì)胞增殖速率明顯降低(P0.05)；與次相反,CUL4B過表達(dá)的細(xì)胞系(PLOC-CUL4B)與對(duì)照組(PLOC)相比,細(xì)胞增殖速率顯著增加(P0.01)。采用克隆形成方法檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細(xì)胞較shControl組相比,14天后細(xì)胞克隆形成率明顯降低(P0.01)；與次相反,PLOC-CUL4B細(xì)胞與PLOC組相比,克隆形成率明顯增加(P0.001)。運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷徙能力,24小時(shí)后進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細(xì)胞較shControl組相比,細(xì)胞遷徙速率明顯降低(P0.05)；與次相反,PLOC-CUL4B細(xì)胞與PLOC組相比,細(xì)胞遷徙速率明顯增加(P0.05)。運(yùn)用Transwel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細(xì)胞較shControl組相比,細(xì)胞侵襲速率明顯降低(P0.05)；與次相反,PLOC-CUL4B細(xì)胞與PLOC組相比,細(xì)胞侵襲速率明顯增加(P0.01)。4. CUL4B表達(dá)水平的變化影響RCC細(xì)胞系在裸鼠中的成瘤能力。為了進(jìn)一步明確CUL4B具有促進(jìn)RCC生長(zhǎng)的作用,應(yīng)用CUL4B干擾的RCC細(xì)胞和BALB-c雄性小鼠進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。8周后明確裸鼠中腫瘤的大小,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細(xì)胞系較對(duì)照組相比,成瘤體積明顯減少(P0.001)。綜合第一部分的研究?jī)?nèi)容：CUL4B在RCC中表達(dá)明顯增加,并且CUL4B的表達(dá)水平與RCC的分級(jí)分期密切相關(guān),CUL4B表達(dá)水平的增加造成RCC較差的核分級(jí)與病理分期。CUL4B表達(dá)水平的增加與RCC患者預(yù)后較差也關(guān)系密切。進(jìn)一步細(xì)胞水平的研究也證實(shí),CUL4B的表達(dá)水平與RCC細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲遷移以及成瘤能力密切相關(guān)。第二部分CUL4B調(diào)控c-Met通路對(duì)腎細(xì)胞癌的影響通過第一部分的研究,發(fā)現(xiàn)CUL4B在RCC中行使重要功能,但是其詳細(xì)的分子機(jī)制,目前研究尚不透徹。為進(jìn)一步探討CUL4B在RCC中的作用機(jī)制,展開了第二部分的研究。1.干擾CUL4B的RCC細(xì)胞中c-Met磷酸化水平降低。由于RTK的激活在RCC發(fā)生進(jìn)展中行使重要功能,因此目前治療轉(zhuǎn)移性RCC的靶向藥物大部分是酪氨酸激酶抑制劑(Inhibitor of tyrosine kinase, TKI)。鑒于以上情況,采用RTK磷酸化水平蛋白芯片,檢測(cè)干擾掉CUL4B的RCC細(xì)胞中RTK的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細(xì)胞較對(duì)照組相比,c-Met、PDGFR-αTNK1、Tie-1及PDGFR-β等RTK的磷酸化水平都有不同程度的降低；其中c-Met磷酸化水平下降80%,下降程度最明顯。2. c-Met在RCC中表達(dá)上調(diào)且與CUL4B表達(dá)水平正相關(guān)。(1)從33對(duì)RCC標(biāo)本中取出10對(duì)CUL4B高表達(dá)的標(biāo)本,采用western blot的方法檢測(cè)c-Met蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)在10對(duì)標(biāo)本中,c-Met在腫瘤中的蛋白水平與正常組織相比,顯著性升高,與CUL4B表達(dá)水平相一致。(2)應(yīng)用western blot的方法檢測(cè)c-Met在3種RCC細(xì)胞769-P、 786-O、 OS-RC-2以及HK-2中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)c-Met在3種RCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平均明顯高于HK-2中的表達(dá)水平,與CUL4B變化相一致。(3)應(yīng)用RCC組織芯片,采用IHC方法檢測(cè)c-Met的蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)c-Met的表達(dá)水平與年齡無關(guān)(P=0.688),與性別無關(guān)(P=0.398),與腫瘤核分級(jí)呈正相關(guān)(P=0.008),與病理分期呈正相關(guān)(P=0.002),與腫瘤大小無關(guān)(P=0.002)。隨后,運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析,對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)c-Met高表達(dá)患者腫瘤特異性生存率降低(P0.001)。對(duì)CUL4B與c-Met的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CUL4B與c-Met的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P=0.02)。3. CUL4B正向調(diào)控c-Met通路。運(yùn)用干擾掉CUL4B或過表達(dá)CUL4B的RCC細(xì)胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。采用Western blot對(duì)c-Met通路上的關(guān)鍵分子表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的細(xì)胞系較對(duì)照細(xì)胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明顯降低。與此相反,CUL4B過表達(dá)的細(xì)胞系較對(duì)照細(xì)胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明顯升高。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法測(cè)定4種細(xì)胞模型中c-Met的mRNA表達(dá)水平,有趣的是,發(fā)現(xiàn)c-Met在4種細(xì)胞中的mRNA水平無顯著性改變。為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)論,我們應(yīng)用CUL4B基因敲除小鼠,應(yīng)用Western blot方法測(cè)定CUL4B敲除小鼠腎臟中c-Met蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)敲除CUL4B的小鼠腎臟中c-Met表達(dá)水平也顯著降低。4. CUL4B通過上調(diào)c-Met促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲轉(zhuǎn)移。采用CUL4B過表達(dá)的RCC細(xì)胞,加入c-Met抑制劑SU11274,檢測(cè)RCC細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲轉(zhuǎn)移能力。RCC細(xì)胞的增殖狀態(tài)通過MTT的方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞較未處理的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞相比,細(xì)胞增殖速率明顯降低(P0.01)。采用克隆形成方法檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力,發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞較未處理的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞相比,14天后細(xì)胞克隆形成率明顯降低(P0.001)。RCC細(xì)胞的侵襲狀態(tài)通過Transwe的方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞較未處理的CUL4B過表達(dá)RCC細(xì)胞相比,細(xì)胞侵襲速率明顯降低(P0.001)。5. CUL4B通過上調(diào)c-Met誘導(dǎo)RCC細(xì)胞對(duì)一線TKI產(chǎn)生耐藥,應(yīng)用c-Met抑制劑后可逆轉(zhuǎn)RCC細(xì)胞的耐藥性。(1)運(yùn)用干擾掉CUL4B或過表達(dá)CUL4B的RCC細(xì)胞模型(shControl、 shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B),加入一線TKI舒尼替尼(Sunitinib),應(yīng)用MTT方法檢測(cè)腎癌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同濃度Sunitinib的反應(yīng)。用10μM和20μM的Sunitinib作用48h后,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞活性明顯降低(P0.01)；與此相反,CUL4B過表達(dá)的RCC細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)(P0.01和P0.001)。用20μM的Sunitinib分別處理細(xì)胞24h、48h和72h后,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞活性明顯降低(P0.05,P0.01和P0.001)；與此相反,CUL4B過表達(dá)的RCC細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)(P0.05、P0.01和P0.01)。(2)將c-Met抑制劑SU11274預(yù)先加入干擾掉CUL4B或過表達(dá)CUL4B的RCC細(xì)胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)中,然后加入Sunitinib,應(yīng)用MTT方法檢測(cè)腎癌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同濃度Sunitinib的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B或過表達(dá)CUL4B的RCC細(xì)胞對(duì)Sunitinib的反應(yīng)無顯著性差異。綜合第二部分內(nèi)容,發(fā)現(xiàn)CUL4B通過調(diào)控c-Met通路對(duì)RCC的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后發(fā)揮著重要作用。此外,CUL4B通過激活c-Met通路促進(jìn)RCC對(duì)一線靶向藥物產(chǎn)生耐藥性,c-Met通路的阻斷可逆轉(zhuǎn)這一耐藥性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11
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本文編號(hào)：1723983