發(fā)布時間：2018-04-09 00:13

  本文選題：腎細胞癌　切入點：CUL4B　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)起源于腎實質腎小管上皮細胞,其發(fā)病率高,大約90%的腎臟惡性腫瘤為RCC。隨著人們生活方式和生活環(huán)境的改變,腎癌的發(fā)病率不斷增加。據(jù)世界癌癥中心資料顯示,2015年美國預測新發(fā)的腎癌患者人數(shù)為61,560,腫瘤特異性死亡患者數(shù)目也高達14,080。我國腎癌的患病人數(shù)也逐年增加,少于膀胱癌成為泌尿男生殖系第二位腫瘤。對于晚期轉移性RCC患者來說,免疫治療和靶向藥物治療已成為各大指南推薦的治療策略。尤其隨著分子遺傳學的發(fā)展,越來越多的分子信號通路被發(fā)現(xiàn)在RCC中行使著重要的功能。在此基礎上,美國、歐洲以及中國批準了越來越多的靶向藥物用于治療晚期轉移性RCC。然而,隨著分子靶向藥物的應用,靶向藥物的耐藥性問題嚴重影響了RCC治療的療效。因此尋找RCC發(fā)生發(fā)生進展中新的靶點以及信號通路,預測RCC患者的預后,指導靶向藥物的選擇以及尋求靶向藥物耐藥后的解決方案已成為晚期轉移性RCC研究中亟待解決的問題。Cullins進化上高度同源,參與構成了最大的E3泛素連接酶,參與調控細胞周期、轉錄、信號轉導和發(fā)育等重要的生物進程。人類基因編碼8種Cullin成員,包括CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC。CUL4B在細胞增值、DNA復制及細胞周期調控等方面行使相應功能。X染色體上CUL4B發(fā)生突變可以造成精神發(fā)育遲滯。敲除CUL4B的小鼠在胚胎階段發(fā)生死亡。除此以外,CUL4B具有定位于細胞核的信號,在細胞核里面行使相關功能。研究證實CUL4B能夠抑制miR-372和miR-373,上調CDK2的表達,從而促進DNA的復制。此外,CUL4B能夠下調抑癌基因p16、PTEN等的功能,促進腫瘤的發(fā)生。因此,最近一段時間許多研究都發(fā)現(xiàn)了CUL4B在惡性腫瘤中行使相應的功能。研究發(fā)現(xiàn)CUL4B與肝癌、結直腸癌、膠質瘤、骨肉瘤以及腫瘤微環(huán)境等密切相關。但是,CUL4B在泌尿系統(tǒng)的腫瘤尤其是RCC中的作用及機制尚未有文獻報道。c-Met是酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK),與其特異性配體肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)相結合后,發(fā)生同源二聚化和磷酸化,從而發(fā)揮相應的作用。c-Met與HGF結合后激活一系列通路,包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路以及黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)通路等。HGF/MET是調控血管生成、細胞增殖、細胞周期以及細胞侵襲轉移等的重要信號通路。盡管c-Met在正常生理條件下對于維持組織穩(wěn)態(tài)非常重要,但是c-Met突變、擴增以及過表達等變化,造成其在人類腫瘤中異常激活。研究發(fā)現(xiàn)c-Met在腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)和乳頭狀腎細胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)中均過表達。c-Met的表達水平與RCC的病理特性以及疾病的預后轉歸關系密切。因此c-Met抑制劑如卡博替尼等作為RCC治療中的靶向藥物也紛紛進入臨床試驗階段。近期研究表明c-Met激活與惡性腫瘤分子靶向藥物治療中的耐藥問題關系密切。因此,c-Met在RCC發(fā)生發(fā)展及靶向藥物耐藥等方面具有重要研究價值,但是CUL4B對c-Met通路是否有調控作用,目前尚未有文獻報道�；谝陨涎芯勘尘�,我展開了下面的研究：首先,探討CUL4B在RCC中的表達及作用；然后,尋找CUL4B在RCC中的作用機制,通過蛋白芯片發(fā)現(xiàn)c-Met可能在CUL4B的調控中發(fā)揮重要作用；最后進一步探討CUL4B調控c-Met通路對RCC的影響。通過本課題的研究以期發(fā)現(xiàn)RCC發(fā)生進展中新的靶點和分子信號通路,從而更好地預測RCC患者的預后、指導靶向藥物的選擇以及尋求靶向藥物耐藥后的解決方案。第一部分CUL4B在腎細胞癌中的表達及作用已知CUL4B在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用,且表達量都升高,為進一步探討CUL4B在RCC中是否同樣具有促進腫瘤發(fā)生進展的作用,本部分利用了人腎細胞癌細胞系、人腎癌組織標本以及裸鼠成瘤動物模型等實驗對象,展開相應研究。具體情況如下：1.CUL4B在RCC細胞系以及RCC組織中表達升高：細胞培養(yǎng)RCC細胞系769-P、786-0和OS-RC-2以及正常的永生化的腎小管上皮細胞系HK-2,運用western blot的方法測定CUL4B在以上細胞系中的表達水平,發(fā)現(xiàn)CUL4B在3種RCC細胞系中的表達水平明顯均高于HK-2中的表達水平。收集33例腎臟腫瘤術后,病理已證實的RCC標本,同時收集腫瘤旁邊正常腎臟組織,同樣運用western blot的方法檢測CUL4B在33對RCC組織和正常腎皮質中蛋白表達水平的差異,發(fā)現(xiàn)CUL4B在其中27對(81.8%)組織中,腫瘤比瘤旁表達含量高。2. CUL4B的表達水平與RCC的分級、分期以及預后等呈正相關關系：應用RCC的組織芯片,芯片中包含90例RCC患者的基本病理信息以及隨訪數(shù)據(jù)。采用免疫組織化學(IHC)染色的技術,對CUL4B的表達水平進行檢測。反應RCC中CUL4B表達的總得分為組織染色強度評分乘以組織染色陽性率得分。得分6分評為高表達,反之為低表達。分別統(tǒng)計CUL4B高表達和低表達的人數(shù),運用卡法檢驗計算CUL4B的表達水平與患者年齡、性別、核分級、病理分期以及腫瘤大小的關系。發(fā)現(xiàn)CUL4B的表達水平與年齡無關(P=0.278),與性別無關(P=0.876),與腫瘤核分級呈正相關(P=0.006),與病理分期呈正相關(P=0.02),與腫瘤大小無關(P=0.054)。隨后,運用Kaplan-Meier生存分析,對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行對數(shù)秩檢驗,發(fā)現(xiàn)CUL4B高表達患者腫瘤特異性生存率降低(P=0.031)。3. CUL4B表達水平的變化影響RCC細胞系增殖、克隆形成、侵襲及遷移等生物學行為：運用慢病毒感染的方法成功構建CUL4B干擾或過表達的RCC細胞系模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。應用Western blot測定CUL4B干擾或過表達的RCC細胞已構建成功。采用MTT來檢測細胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)CUL4B干擾的RCC細胞系(shCUL4B)較對照組(shControl)相比,細胞增殖速率明顯降低(P0.05)；與次相反,CUL4B過表達的細胞系(PLOC-CUL4B)與對照組(PLOC)相比,細胞增殖速率顯著增加(P0.01)。采用克隆形成方法檢測細胞克隆形成能力,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細胞較shControl組相比,14天后細胞克隆形成率明顯降低(P0.01)；與次相反,PLOC-CUL4B細胞與PLOC組相比,克隆形成率明顯增加(P0.001)。運用劃痕實驗檢測細胞遷徙能力,24小時后進行觀察,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細胞較shControl組相比,細胞遷徙速率明顯降低(P0.05)；與次相反,PLOC-CUL4B細胞與PLOC組相比,細胞遷徙速率明顯增加(P0.05)。運用Transwel實驗檢測細胞侵襲能力,發(fā)現(xiàn)shCUL4B細胞較shControl組相比,細胞侵襲速率明顯降低(P0.05)；與次相反,PLOC-CUL4B細胞與PLOC組相比,細胞侵襲速率明顯增加(P0.01)。4. CUL4B表達水平的變化影響RCC細胞系在裸鼠中的成瘤能力。為了進一步明確CUL4B具有促進RCC生長的作用,應用CUL4B干擾的RCC細胞和BALB-c雄性小鼠進行裸鼠成瘤實驗。8周后明確裸鼠中腫瘤的大小,進行統(tǒng)計學分析,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細胞系較對照組相比,成瘤體積明顯減少(P0.001)。綜合第一部分的研究內容：CUL4B在RCC中表達明顯增加,并且CUL4B的表達水平與RCC的分級分期密切相關,CUL4B表達水平的增加造成RCC較差的核分級與病理分期。CUL4B表達水平的增加與RCC患者預后較差也關系密切。進一步細胞水平的研究也證實,CUL4B的表達水平與RCC細胞的增殖、克隆形成、侵襲遷移以及成瘤能力密切相關。第二部分CUL4B調控c-Met通路對腎細胞癌的影響通過第一部分的研究,發(fā)現(xiàn)CUL4B在RCC中行使重要功能,但是其詳細的分子機制,目前研究尚不透徹。為進一步探討CUL4B在RCC中的作用機制,展開了第二部分的研究。1.干擾CUL4B的RCC細胞中c-Met磷酸化水平降低。由于RTK的激活在RCC發(fā)生進展中行使重要功能,因此目前治療轉移性RCC的靶向藥物大部分是酪氨酸激酶抑制劑(Inhibitor of tyrosine kinase, TKI)。鑒于以上情況,采用RTK磷酸化水平蛋白芯片,檢測干擾掉CUL4B的RCC細胞中RTK的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細胞較對照組相比,c-Met、PDGFR-αTNK1、Tie-1及PDGFR-β等RTK的磷酸化水平都有不同程度的降低；其中c-Met磷酸化水平下降80%,下降程度最明顯。2. c-Met在RCC中表達上調且與CUL4B表達水平正相關。(1)從33對RCC標本中取出10對CUL4B高表達的標本,采用western blot的方法檢測c-Met蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)在10對標本中,c-Met在腫瘤中的蛋白水平與正常組織相比,顯著性升高,與CUL4B表達水平相一致。(2)應用western blot的方法檢測c-Met在3種RCC細胞769-P、 786-O、 OS-RC-2以及HK-2中的表達情況。發(fā)現(xiàn)c-Met在3種RCC細胞系中的表達水平均明顯高于HK-2中的表達水平,與CUL4B變化相一致。(3)應用RCC組織芯片,采用IHC方法檢測c-Met的蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)c-Met的表達水平與年齡無關(P=0.688),與性別無關(P=0.398),與腫瘤核分級呈正相關(P=0.008),與病理分期呈正相關(P=0.002),與腫瘤大小無關(P=0.002)。隨后,運用Kaplan-Meier生存分析,對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行對數(shù)秩檢驗,發(fā)現(xiàn)c-Met高表達患者腫瘤特異性生存率降低(P0.001)。對CUL4B與c-Met的表達水平進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)CUL4B與c-Met的表達水平呈正相關(P=0.02)。3. CUL4B正向調控c-Met通路。運用干擾掉CUL4B或過表達CUL4B的RCC細胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。采用Western blot對c-Met通路上的關鍵分子表達水平進行檢測。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的細胞系較對照細胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明顯降低。與此相反,CUL4B過表達的細胞系較對照細胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明顯升高。運用實時定量RT-PCR的方法測定4種細胞模型中c-Met的mRNA表達水平,有趣的是,發(fā)現(xiàn)c-Met在4種細胞中的mRNA水平無顯著性改變。為進一步驗證我們的結論,我們應用CUL4B基因敲除小鼠,應用Western blot方法測定CUL4B敲除小鼠腎臟中c-Met蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)敲除CUL4B的小鼠腎臟中c-Met表達水平也顯著降低。4. CUL4B通過上調c-Met促進RCC細胞增殖、克隆形成及侵襲轉移。采用CUL4B過表達的RCC細胞,加入c-Met抑制劑SU11274,檢測RCC細胞增殖、克隆形成及侵襲轉移能力。RCC細胞的增殖狀態(tài)通過MTT的方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達RCC細胞較未處理的CUL4B過表達RCC細胞相比,細胞增殖速率明顯降低(P0.01)。采用克隆形成方法檢測細胞克隆形成能力,發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達RCC細胞較未處理的CUL4B過表達RCC細胞相比,14天后細胞克隆形成率明顯降低(P0.001)。RCC細胞的侵襲狀態(tài)通過Transwe的方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)加入c-Met抑制劑SU11274的CUL4B過表達RCC細胞較未處理的CUL4B過表達RCC細胞相比,細胞侵襲速率明顯降低(P0.001)。5. CUL4B通過上調c-Met誘導RCC細胞對一線TKI產生耐藥,應用c-Met抑制劑后可逆轉RCC細胞的耐藥性。(1)運用干擾掉CUL4B或過表達CUL4B的RCC細胞模型(shControl、 shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B),加入一線TKI舒尼替尼(Sunitinib),應用MTT方法檢測腎癌細胞在不同時間點對不同濃度Sunitinib的反應。用10μM和20μM的Sunitinib作用48h后,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細胞較對照細胞相比,細胞活性明顯降低(P0.01)；與此相反,CUL4B過表達的RCC細胞較對照細胞相比,細胞活性顯著增強(P0.01和P0.001)。用20μM的Sunitinib分別處理細胞24h、48h和72h后,發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B的RCC細胞較對照細胞相比,細胞活性明顯降低(P0.05,P0.01和P0.001)；與此相反,CUL4B過表達的RCC細胞較對照細胞相比,細胞活性顯著增強(P0.05、P0.01和P0.01)。(2)將c-Met抑制劑SU11274預先加入干擾掉CUL4B或過表達CUL4B的RCC細胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)中,然后加入Sunitinib,應用MTT方法檢測腎癌細胞在不同時間點對不同濃度Sunitinib的反應。發(fā)現(xiàn)干擾掉CUL4B或過表達CUL4B的RCC細胞對Sunitinib的反應無顯著性差異。綜合第二部分內容,發(fā)現(xiàn)CUL4B通過調控c-Met通路對RCC的增殖、侵襲轉移及預后發(fā)揮著重要作用。此外,CUL4B通過激活c-Met通路促進RCC對一線靶向藥物產生耐藥性,c-Met通路的阻斷可逆轉這一耐藥性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
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本文編號：1723983