本文選題：MDM2　切入點(diǎn)：有絲分裂災(zāi)難　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：足細(xì)胞損傷和丟失是糖尿病腎病(DN)發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié),然而高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷和丟失的具體機(jī)制尚未完全闡明。研究表明,作為終末分化細(xì)胞,足細(xì)胞一旦重新進(jìn)入細(xì)胞周期發(fā)生有絲分裂將走向死亡一即有絲分裂災(zāi)難。MDM2是一種E3泛素連接酶,可通過多種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期和有絲分裂。既往研究發(fā)現(xiàn)MDM2在腎小管及腎小球足細(xì)胞有表達(dá),但其在腎臟疾病相關(guān)的細(xì)胞周期及有絲分裂異常中的作用尚未見報(bào)道。本研究采用臨床DN患者腎活檢標(biāo)本、DN小鼠模型和條件永生化足細(xì)胞為研究對(duì)象,研究足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難在DN進(jìn)程中的病理生理意義并探討MDM2在足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難發(fā)生中的關(guān)鍵作用,以期為DN的早期防治提供新的理論依據(jù)。第一部分MIDM2參與誘導(dǎo)高糖環(huán)境下足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難目的：(1)觀察MDM2在DN患者、DN模型小鼠腎小球及高糖環(huán)境下足細(xì)胞的表達(dá)情況;(2)觀察體內(nèi)及體外高糖環(huán)境中足細(xì)胞有絲分裂情況并探究MDM2在其中所起的作用。方法：(1)通過單次腹腔注射STZ建立DN小鼠模型;(2)利用共聚焦顯微鏡及免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)MDM2表達(dá)水平與DN小鼠足細(xì)胞標(biāo)志分子Synaptopodin的共定位情況；(3)通過透射電鏡觀察DN患者足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；(4)通過慢病毒轉(zhuǎn)染敲低MDM2在體外人足細(xì)胞的表達(dá)；(5)采用Western blot方法檢測(cè)MDM2及有絲分裂標(biāo)志分子Aurora B和p-H3-ser10蛋白在高糖環(huán)境下足細(xì)胞的表達(dá),以及敲低MDM2后有絲分裂標(biāo)志分子的表達(dá)變化；(6)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖以及MDM2敲低對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；(7)使用鬼筆環(huán)肽染色F-actin及LDH細(xì)胞毒性活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)人足細(xì)胞的損傷以及敲低MDM2后對(duì)足細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果：(1)DN患者和STZ誘導(dǎo)的DN模型小鼠腎小球中MDM2表達(dá)水平升高,且MDM2與DN小鼠足細(xì)胞標(biāo)記蛋白synaptopodin共定位增加：(3)DN患者腎活檢標(biāo)本中,存在發(fā)生異常有絲分裂的足細(xì)胞,且在體外高糖環(huán)境下增殖細(xì)胞標(biāo)志Ki67、有絲分裂標(biāo)志分子Aurora B和p-H3-ser10表達(dá)上調(diào),S期和G2/M期細(xì)胞增多,說明體外足細(xì)胞在高糖刺激下重新進(jìn)入細(xì)胞周期并發(fā)生有絲分裂；(3)在體外高糖環(huán)境下足細(xì)胞MDM2表達(dá)增多,敲低MDM2可減輕高糖所致的Ki67、Aurora B和p-H3-ser10表達(dá)上調(diào),并可減輕高糖所致的G2/M期細(xì)胞比例增加;(4)在體外培養(yǎng)足細(xì)胞中敲低MDM2可部分逆轉(zhuǎn)高糖所致的足細(xì)胞F-actin排列異常及LDH釋放增多,從而減輕足細(xì)胞損傷。結(jié)論：(1)DN小鼠和體外高糖環(huán)境下的人足細(xì)胞中存在足細(xì)胞有絲分裂異常并伴隨MDM2表達(dá)增加；(2)敲低MDM2可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難從而減輕足細(xì)胞損傷。第二部分高糖環(huán)境下MDM2參與介導(dǎo)足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難的可能機(jī)制目的：(1)探究高糖環(huán)境下MDM2是否通過p53依賴途徑介導(dǎo)足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難：(2)探究高糖環(huán)境下MDM2是否通過非p53依賴途徑介導(dǎo)足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難。方法：(1)通過Western blot方法檢測(cè)nutlin3a對(duì)足細(xì)胞p53的表達(dá)水平及高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷標(biāo)志分子Desmin表達(dá)上調(diào)的影響,從而判斷p53是否是介導(dǎo)MDM2誘導(dǎo)的足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難的下游因子;(2)通過免疫熒光及Western blot方法觀察Numb和NICD在DN小鼠腎小球中的表達(dá)情況；(3)檢測(cè)Numb.NICD及其下游分子Hes1在高糖環(huán)境下足細(xì)胞的表達(dá)情況,以及敲低MDM2后Numb、 NICD以及其下游分子Hes1的表達(dá)變化；(4)通過siRNA敲低足細(xì)胞中NICD的表達(dá),并采用Western blot方法檢測(cè)有絲分裂標(biāo)志分子Aurora B和p-H3-ser10蛋白的表達(dá),以判斷NICD是否是介導(dǎo)MDM2誘導(dǎo)的足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難的下游因子。結(jié)果：(1)在體外,nutlin3a干預(yù)可影響足細(xì)胞P53及MDM2的表達(dá),但對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷無明顯影響;(2)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病腎病模型小鼠腎小球中Numb表達(dá)水平降低,而DN小鼠腎皮質(zhì)NICD表達(dá)水平升高；(3)在體外人足細(xì)胞中敲低MDM2基因表達(dá)可引起Numb、NICD及其下游分子Hes1的表達(dá)變化;(4)在體外永生化足細(xì)胞中敲低NICD基因表達(dá)可減輕足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難。結(jié)論：(1)MDM2通過非p53途徑介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難：(2)高糖環(huán)境下足細(xì)胞中Numb-Notch1是MDM2的下游通路,MDM2可能通過此通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：1721714