發(fā)布時間：2018-04-02 13:18

  本文選題：硫酸吲哚酚　切入點：Klotho　出處：《第三軍醫(yī)大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景及意義 尿毒癥心肌病(Uremic Cardiomyopathy)是慢性腎病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者最常見的并發(fā)癥和死亡原因。左室肥厚(Left Ventricular Hypertrophy, LVH)是尿毒癥心肌病最顯著的病變特征,既往研究表明高血壓和容量負荷增加是左室肥厚的重要誘因,但控制血壓和減輕容量負荷并不能阻止CKD患者LVH的持續(xù)進展。近年來的研究則更加關(guān)注CKD患者特殊的內(nèi)環(huán)境改變與心血管并發(fā)癥的關(guān)系,而氧化應激在其中的作用顯得尤為突出,研究證實氧化應激是導致LVH的一個重要因素。與普通人群不同,CKD患者長期處于高氧化應激狀態(tài),這與患者腎功能減退后體內(nèi)大量毒素蓄積有關(guān),特別是硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate, IS)等蛋白結(jié)合毒素,可以刺激細胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)過量生成、提高機體氧化應激水平,并且常規(guī)透析并不能將它們有效清除,于是長時間大量存在于血循環(huán)之中,嚴重危害心血管系統(tǒng)。因此,尿毒癥毒素極有可能通過上調(diào)機體氧化應激水平促進尿毒癥心肌病的發(fā)生和發(fā)展,而明確尿毒癥毒素誘導LVH的作用將從一全新的角度揭示尿毒癥心肌病的發(fā)病機制,在此基礎上探討有效的防治措施也具有非常重要的臨床意義。 Klotho基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因,僅在腎臟、脈絡膜和生殖器官等少數(shù)組織器官中表達。分泌型Klotho蛋白能夠進入血液循環(huán),作為體液因子發(fā)揮生理作用。研究發(fā)現(xiàn),Klotho抗衰老作用與其強大的抗氧化應激效應密切相關(guān)。Klotho基因過表達的小鼠不但壽命延長,其體內(nèi)ROS生成量也明顯減少。已有研究證實,分泌型Klotho蛋白能夠促進胞內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)生成,加速ROS的清除；該基因轉(zhuǎn)染的高血壓大鼠,腎臟和主動脈NADPH氧化酶2(NADPH Oxidase2, NOX2)的表達受抑,超氧化物生成減少,進而延緩腎臟和血管功能的損害。雖然Klotho對氧化應激的影響機制尚未研究透徹,但Klotho抑制ROS生成以及清除過量ROS的功能是肯定的,即分泌型Klotho蛋白是機體一種極為重要的內(nèi)源性抗氧化應激蛋白。 由于Klotho僅在體內(nèi)有限的組織器官中表達分泌,且主要在腎小管上皮細胞高表達,該基因缺陷小鼠的表型與尿毒癥患者極為相似,在短時間內(nèi)即可快速出現(xiàn)心血管疾病和死亡,因此,Klotho和慢性腎病心血管并發(fā)癥的關(guān)系引起了人們的重視。我們以往的研究證實尿毒癥小鼠腎臟Klotho表達和血清Klotho水平均明顯下降；而Klotho基因轉(zhuǎn)染的尿毒癥小鼠其動脈粥樣硬化的病理改變得到了顯著改善。這提示在CKD時Klotho表達明顯降低,若上調(diào)Klotho表達則可以改善CKD的血管病變。晚近研究發(fā)現(xiàn),Klotho基因敲除小鼠存在明顯的LVH,其機制并不明確,但這初步說明Klotho與LVH的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。我們推測,在CKD時尿毒癥毒素可能通過提高氧化應激水平誘發(fā)LVH；同時,腎臟病變又可導致Klotho蛋白表達和分泌降低,使得機體內(nèi)源性抗氧化應激能力下降,對尿毒癥毒素誘發(fā)的LVH的抑制作用減弱,體內(nèi)這種氧化與抗氧化的失衡可能是CKD時LVH高發(fā)和快速進展的原因之一。而上調(diào)Klotho表達或外源性補充Klotho蛋白則可能通過提高機體的抗氧化應激水平抑制CKD時LVH的發(fā)生和發(fā)展,從而改善尿毒癥心肌病。 為此,本研究以新生大鼠心肌細胞作為體外研究對象,并且以尿毒癥模型小鼠和Klotho基因敲除雜合子(kl/+)小鼠作為體內(nèi)實驗對象,分以下4個部分對Klotho干預IS誘導LVH的作用和機制進行了研究：①IS誘導心肌細胞肥大的作用及機制研究；Klotho對IS誘導心肌細胞肥大的干預作用及機制；③通過腹腔注射IS,觀察并比較研究kl/+小鼠和正常小鼠LVH情況；④構(gòu)建尿毒癥小鼠模型,觀察腹腔注射Klotho對小鼠LVH的影響,明確外源性補充Klotho是否可以減輕尿毒癥LVH。 研究結(jié)果： 1、C57BL/6J小鼠腹腔注射IS(100mg/kg/d)8周后HPLC-FLU法檢測小鼠血清IS濃度,發(fā)現(xiàn)血清中IS濃度約為對照組小鼠的5倍,而western blot檢測提示腎臟Klotho蛋白表達量卻明顯下降。kl/+小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠腹腔注射IS8周后超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn),kl/+小鼠左心室后壁厚度(Left Ventricular Posterior Wall Thickness, LVPWT)和心體比均顯著增加,舒張期左心室內(nèi)徑(Left Ventricular Internal Diameter at End-Diastolel, LVIDD)降低。與WT小鼠相比,kl/+小鼠在IS注射8周后LVH更為明顯。上述結(jié)果表明,血清IS濃度增加是誘發(fā)LVH的原因之一,而IS誘導LVH發(fā)生的同時還可以降低腎臟Klotho表達；而一旦機體內(nèi)Klotho缺乏,IS誘導LVH的作用會進一步增強,提示Klotho可以拮抗IS誘導的LVH。 2、5、50、500μmol/L的IS可以劑量依賴性的增加心肌細胞[3H]-亮氨酸([3H]-leucine)的攝入量,500μmol/L的IS孵育明顯增加心肌細胞體積,心肌肥大標志基因ANF、BNP和β-MHC mRNA表達增加,提示IS的確可以誘導心肌細胞肥大。但用400pmol/L Klotho蛋白預處理心肌細胞1h后再給予IS孵育,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與僅用IS孵育的心肌細胞相比,[3H]-leucine攝入量減少,肥大的心肌細胞體積變小,且心肌肥大標志基因ANF、BNP和β-MHC mRNA的表達明顯下調(diào),而ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)亦存在上述作用。說明Klotho和抗氧化劑NAC一樣可以拮抗IS誘導的心肌細胞肥大,而抑制氧化應激可以減弱IS促心肌細胞肥大的作用。 3、為了進一步明確IS誘導心肌細胞肥大以及Klotho拮抗該作用的機制,我們繼續(xù)深化了體外實驗研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低劑量IS既能快速促進心肌細胞內(nèi)ROS生成,500μmol/L IS孵育心肌細胞10min后,ROS水平較對照組增高2倍。而200pmol/L和400pmol/L Klotho、10μmol/L DPI(NADPH氧化酶的抑制劑)和5mmol/L NAC預孵育心肌細胞1h,均能夠明顯抑制IS誘導的ROS生成增多。與DPI的作用相似,Klotho預孵育可以顯著下調(diào)IS誘導的心肌細胞NOX2和NOX4高表達。 已有報道證實ROS下游信號通路MAPK家族的活化在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用。我們隨后探討了IS處理后心肌細胞中ROS過量生成和MAPK活化的關(guān)系。western blot檢測提示,IS孵育心肌細胞15-60min能夠刺激p38和ERK1/2的磷酸化,而JNK的變化則不明顯,10μmol/L DPI或400pmol/L Klotho預孵育細胞1h則能夠顯著抑制p38和ERK1/2的磷酸化。與p38和ERK1/2抑制劑(SB203580和U0126)的作用一致,NOX抑制劑DPI預孵育能夠明顯減慢IS誘導的心肌細胞蛋白合成增加,下調(diào)ANF、BNP和β-MHC mRNA表達。這說明IS可能是通過活化ROS/MAPK(p38和ERK1/2)信號通路誘導了心肌細胞肥大,而Klotho可以拮抗該信號通路的活化。結(jié)合上述研究結(jié)果,我們得出如下結(jié)論：IS通過促進NOX2和NOX4來源的ROS生成增強了心肌細胞的氧化應激水平,隨后激活了ROS下游的p38和ERK1/2導致了心肌細胞肥大,而Klotho可以通過抑制NOX2和NOX4的表達減少IS誘導的心肌細胞ROS生成和下游信號活化,由于其作用與抗氧化劑NAC和NOX抑制劑DPI一致,故其拮抗IS誘導心肌細胞肥大的作用可能還是通過抗氧化應激而實現(xiàn)的。 4、12周齡BALB/c小鼠行左腎皮質(zhì)電灼術(shù),2周后再將右腎全切,構(gòu)建尿毒癥小鼠模型。經(jīng)手術(shù)誘導腎功能衰竭(Surgically Induced Renal Failure, SIRF)小鼠建模后第4周,殘余腎中Klotho的表達和血清中Klotho的含量明顯降低,血清IS濃度明顯升高。與假手術(shù)(Sham)組相比較,SIRF組小鼠心肌組織NOX2和NOX4的表達顯著增高,ROS含量也明顯增加。而腹腔注射Klotho蛋白(0.01mg/kg/48h)可以顯著抑制SIRF小鼠心肌組織NOX2和NOX4的表達及ROS生成。不僅如此,外源性補充Klotho能夠顯著改善SIRF小鼠的LVH,與腹腔注射PBS的SIRF小鼠相比,給予Klotho治療的模型小鼠LVPWT和心體比降低,LVIDD增加,ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達水平下調(diào)。上述結(jié)果示,外源性補充Klotho能夠明顯改善CKD并發(fā)的LVH。 研究結(jié)論 1、尿毒癥毒素是CKD時發(fā)生LVH的重要誘因之一,尿毒癥毒素IS在誘導LVH發(fā)生的同時還可以抑制腎臟抗氧化應激蛋白Klotho的表達,而Klotho缺乏可以進一步加重IS誘導的LVH。 2、IS通過促進NOX來源的ROS生成誘導了心肌細胞肥大,其作用與ROS下游信號p38和ERK1/2的活化有關(guān)。而Klotho蛋白能夠抑制NOX表達,減弱ROS/MAPKs信號通路活性,拮抗IS誘導的心肌細胞肥大。 3、尿毒癥小鼠血清中IS含量明顯增高,但Klotho水平卻顯著降低。通過外源性補充Klotho蛋白可以顯著抑制尿毒癥小鼠心肌組織NOX2和NOX4的表達及ROS生成,并明顯改善尿毒癥小鼠的LVH。Klotho對LVH的抑制作用可能與其抗氧化應激能力密切相關(guān)。 綜上所述,本研究證實尿毒癥毒素是誘導心肌肥大的重要因素,其機制可能與尿毒癥毒素促氧化應激作用有關(guān)。而Klotho是在機體腎臟表達和分泌的抗氧化應激蛋白,可以拮抗尿毒癥毒素誘導的心肌肥大。兩者在尿毒癥內(nèi)環(huán)境下的失衡可能是LVH發(fā)生和發(fā)展的一個關(guān)鍵因素,而外源性補充Klotho可以顯著改善尿毒癥LVH。本研究不但從心、腎內(nèi)在關(guān)聯(lián)角度出發(fā)揭示了尿毒癥心肌病的發(fā)病機理,并且以上調(diào)機體內(nèi)源性物質(zhì)為靶標可以為臨床提供安全有效的治療思路和治療模式。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692.5

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