本文選題：腎組織干細(xì)胞　切入點(diǎn)：高糖　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：目的：從大鼠腎乳頭處分離培養(yǎng)腎組織干細(xì)胞(KSC)，鑒定其生物學(xué)特征及干細(xì)胞特性。評估高糖對KSC基本特征、旁分泌作用及向腎小管上皮細(xì)胞（RTEC）分化能力的影響。 方法：①從4周齡雄性SD大鼠雙腎腎乳頭部位分離培養(yǎng)KSC，觀察細(xì)胞形態(tài)特征，通過細(xì)胞流式、免疫熒光鑒定KSC的表型特征，通過成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定其分化能力，并通過qRT-PCR比較KSC與RTEC基因表達(dá)的差異。②比較KSC在高糖（30mmol/L）和正糖（5.6mmol/L）培養(yǎng)基的微環(huán)境下細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、相關(guān)表型標(biāo)記物、趨化因子表達(dá)及耐缺氧能力的差異。③分別用正糖和高糖培養(yǎng)基對KCS進(jìn)行預(yù)處理后制備KSC上清，建立大鼠RTEC缺氧/復(fù)氧（H/R）模型，比較高糖與正糖KSC上清對H/R RTEC修復(fù)作用的差異。④對KSC進(jìn)行誘導(dǎo)分化，比較兩種誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)效率的差異；將KSC分別用高糖和正糖培養(yǎng)基預(yù)處理4d，然后按照共培養(yǎng)方案進(jìn)行誘導(dǎo)，比較兩種KSC經(jīng)誘導(dǎo)后成熟上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cad、CK-18、AQP-1表達(dá)的差異。 結(jié)果：①KSC主要呈紡錘形或樹枝狀生長，免疫熒光結(jié)果顯示可表達(dá)α-SMA、Vimentin、N-Cadherin、Nestin、CD133，不表達(dá)E-Cadherin、CK-18、ZO-1，細(xì)胞流式結(jié)果CD29、CD90、CD73、CD45表達(dá)比率分別為99%、95.8%、99.9%和3.4%，干細(xì)胞標(biāo)記CD133和Nestin,陽性率分別為33.2%和70.2%，雙陽性率為31.4%，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色呈紅色，成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色呈橙紅色，Von kossa染色成黑色，qRT-PCR結(jié)果顯示：與RTEC相比，原始胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Nanog、Oct4/pou5f1、Sox2/sry-box-2和間質(zhì)標(biāo)記物-SMA、Vimentin的mRNA表達(dá)量在KSC中顯著增高（P 0.01）,而成熟的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cadherin、CK18的mRNA表達(dá)量在KSC中顯著降低（P 0.01）。②細(xì)胞增殖檢測結(jié)果提示從第4天開始高糖組細(xì)胞生長較正糖組緩慢，免疫熒光結(jié)果提示KCS經(jīng)高糖處理后，纖維連接蛋白（Fibronectin）、I型膠原（Collagean I）、IV型膠原（Collagean IV）的合成增加；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示KSC經(jīng)高糖干預(yù)后，F(xiàn)ibronectin、Collagean I、Collagean IV mRNA表達(dá)增高，間質(zhì)標(biāo)記物-SMA、Vimentin基因表達(dá)進(jìn)一步升高，促纖維化因子TGF-、CTGF、PAI-1mRNA表達(dá)均升高；經(jīng)高糖預(yù)處理96h后，KSC耐缺氧能力下降，低氧培養(yǎng)24h細(xì)胞分裂增殖指數(shù)低于正糖KSC，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）及其受體CXCR4的基因表達(dá)均顯著降低（P0.01）。③缺氧4h/復(fù)氧2h為RTEC H/R模型最佳時間，缺氧后，RTEC凋亡率升高，上清的LDH和MDA水平升高（P0.01），SOD水平降低（P0.01）。進(jìn)行KSC上清干預(yù)12h和24h后，與對照組相比，正糖組和高糖組RTEC的凋亡率均明顯降低，LDH和MDA水平均顯著降低（P0.01），SOD水平均顯著升高（P0.01）。正糖組和高糖組兩組間比較，高糖組RTEC的凋亡率略高于正糖組，LDH和MDA水平要高于正糖組（P0.05），SOD水平要顯著低于高糖組（P0.01）。④細(xì)胞因子誘導(dǎo)的同時與缺氧損傷的RTEC共培養(yǎng)誘導(dǎo)后，CK-18陽性率最高，為44.2%，成熟上皮細(xì)胞標(biāo)記CK-18、E-Cadherin、ZO-1部分陽性表達(dá)。正糖KSC和高糖KSC經(jīng)共培養(yǎng)方案進(jìn)行誘導(dǎo)后，細(xì)胞流式結(jié)果提示，高糖KSC誘導(dǎo)組CK-18陽性率顯著低于正糖組（P=0.045）；qRT-PCR結(jié)果提示，高糖KSC誘導(dǎo)組成熟上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin、AQP-1基因表達(dá)水平顯著低于正糖組（P0.05）。 結(jié)論：①腎乳頭部位可以分離培養(yǎng)出具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的KSC②KSC在高糖的微環(huán)境中細(xì)胞增殖能力下降，促纖維化基因表達(dá)增高、對缺氧的耐受能力降低、趨化因子的表達(dá)量也降低。③KSC上清對缺氧損傷的RTEC有修復(fù)作用，這種作用主要是通過抑制細(xì)胞凋亡、減少氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的，而經(jīng)過高糖預(yù)處理的KSC上清的抗凋亡、抗氧化應(yīng)激作用減弱。④KSC在體外可以誘導(dǎo)分化為RTEC，，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的同時與缺氧損傷的RTEC共培養(yǎng)為最佳誘導(dǎo)方案，高糖使KSC向RTEC分化的誘導(dǎo)效率降低。
[Abstract]:Objective : To isolate and culture kidney tissue stem cells ( KSC ) from rat renal papilla and to identify their biological characteristics and stem cell characteristics .

Methods : 鈶

本文編號：1683329