本文選題：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　切入點(diǎn)：晚期氧化蛋白產(chǎn)物　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是全球范圍內(nèi)引起終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因之一,也是嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。蛋白尿是DN的首要臨床特征,也是判斷DN嚴(yán)重程度的指標(biāo),同時(shí)蛋白尿又是DN進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。腎小球?yàn)V過(guò)屏障的破壞將導(dǎo)致蛋白尿的形成,腎小球?yàn)V過(guò)屏障是由最內(nèi)層的腎小球內(nèi)皮、中間層腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)以及最外層的足細(xì)胞所組成。腎小球足細(xì)胞,又稱之為腎小球臟層上皮細(xì)胞,被認(rèn)為是腎小球?yàn)V過(guò)屏障中最重要的組成成份,在維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障完整性及濾過(guò)功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。足細(xì)胞是一種高度特異性的終末分化細(xì)胞,增殖和再生功能有限,因此,足細(xì)胞的凋亡和丟失最終會(huì)導(dǎo)致DN蛋白尿的形成。而且,越來(lái)越多的研究證據(jù)表明足細(xì)胞凋亡以及從GBM上脫落在蛋白尿和DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而,目前關(guān)于足細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制并不完全清楚。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products,AOPPs)是一種氧化應(yīng)激過(guò)程中行成的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物,在體內(nèi)主要是由白蛋白所形成。Witko Sarsat等首次發(fā)現(xiàn)在尿毒癥患者血漿中AOPPs升高,其中血透患者最高,接著就是腹透患者,再次就是晚期腎功能衰竭非透析患者。隨后,在肥胖者、代謝綜合征、原發(fā)性腎臟病、IgA腎病、合并或不合并微血管病變的糖尿病患者血漿中均發(fā)現(xiàn)AOPPs的聚集。而且,隨著腎功能的惡化AOPPs水平進(jìn)一步升高。因此,AOPPs最近被認(rèn)為是一種新的致腎臟病因子。同時(shí),大量研究報(bào)導(dǎo)血漿AOPPs濃度升高與慢性腎臟病(chronic kidney diseases, CKD)包括糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)。AOPPs處理過(guò)的5/6腎切除后的大鼠出現(xiàn)尿蛋白增加、血清肌酐進(jìn)行性增高以及肌酐清除率下降；并且AOPPs也導(dǎo)致殘腎出現(xiàn)明顯腎纖維化。在鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中外源性AOPPs可加重糖尿病大鼠的蛋白尿。而且,最近周麗麗等通過(guò)體內(nèi)和體外研究證實(shí)了AOPPs與晚期糖基化蛋白產(chǎn)物受體(Receptor of advanced glycation end products, RAGE)結(jié)合后通過(guò)NADPH氧化酶依賴的02-生成機(jī)制誘導(dǎo)了足細(xì)胞凋亡。然而,AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的機(jī)制并沒(méi)有完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)啟動(dòng)的凋亡途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)發(fā)揮著數(shù)種重要的細(xì)胞功能,如：新生蛋白的合成、折疊、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn),以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的調(diào)節(jié)。各種病理生理的因素?cái)_亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚集以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變,最終引起ERS發(fā)生。隨后,ERS將觸發(fā)一系列綜合應(yīng)激通路發(fā)生,稱之為未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedprotein response, UPR),主要引起三條經(jīng)典的UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,是由三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白：PERK (double-stranded RNAactivated protein kinase-like ER Kinase)、 ATF6 (activating transcription factor-6)、IRE1 (inositol-requiring enzyme-1)所啟動(dòng)的。然而,UPR的激活一方面觸發(fā)了恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的適應(yīng)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞生存；另一方面當(dāng)嚴(yán)重持續(xù)的應(yīng)激時(shí)將促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,ERS既是細(xì)胞抵抗損傷因素的生理性適應(yīng)保護(hù)機(jī)制,也是致使細(xì)胞損傷和凋亡的重要病理機(jī)制。GRP78,也稱之為BiP,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶,也是UPR的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；正常情況下,GRP78與PERK、IRE1及ATF6結(jié)合,使它們處于非激活狀態(tài)；一旦ERS發(fā)生,GRP78就與這三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白分離,轉(zhuǎn)而與非折疊蛋白及錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合,因此,GRP78經(jīng)常被當(dāng)成一種ERS的標(biāo)志物。與GRP78解離之后,PERK、IRE1通過(guò)自身磷酸化激活,而ATF6轉(zhuǎn)移到高爾基體內(nèi)切割后激活。激活后的PERK、IRE1及ATF6誘導(dǎo)的信號(hào)通路聚集到CHOP,第一個(gè)被證實(shí)參與調(diào)節(jié)ERS誘導(dǎo)的凋亡的分子。三條UPR通路,特別是PERK,都可通過(guò)誘導(dǎo)CHOP觸發(fā)凋亡。CHOP,也稱之為GADD153,在無(wú)刺激因素下低水平表達(dá)。在ERS時(shí),CHOP表達(dá)上調(diào),因此,也被當(dāng)成是ERS的另外一個(gè)標(biāo)志物。CHOP-/-大鼠在應(yīng)對(duì)ERS時(shí)表現(xiàn)出低的凋亡率,同樣ERS不能誘導(dǎo)CHOP-/-細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn),CHOP在ERS誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。大量研究表明CHOP是通過(guò)抑制抗凋亡因子Bcl-2來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。Caspase-12特異性位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞膜上,而且caspase-12的激活參與了ERS誘導(dǎo)凋亡的執(zhí)行階段。ERS啟動(dòng)后procaspase-12通過(guò)切割后激活,激活后的caspase-12可以進(jìn)一步激活caspase-9,接著催化procaspase-3的切割,促進(jìn)ERS特異性促凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ERS已被廣泛證實(shí)參與了腎臟疾病的腎小球和腎小管損傷。而且,已有研究表明晚期糖基化蛋白產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)、高血糖、白蛋白超負(fù)荷及飽和脂肪酸等多種因素均可通過(guò)激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡。然而,是否ERS參與了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),AOPPs通過(guò)激活ERS誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化；也可通過(guò)激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。因此,我們推測(cè)ERS可能參與了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。而且,如上所述,周麗麗及其同事研究證實(shí)了NADPH氧化酶依賴的02-生成介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,而且AOPPs通過(guò)與RAGE受體結(jié)合,而不是與表達(dá)在足細(xì)胞表面的其他清道夫受體(SRs)如CD36和SRclassA,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。最近研究表明了ERS與氧化應(yīng)激之間存在密切聯(lián)系。ROS與氧化應(yīng)激不但與ERS相關(guān),而且參與了UPR促凋亡信號(hào)通路的整體組成,這也表明ROS的生成與ERS密切相關(guān)聯(lián)。因此,綜上所述,我們推測(cè)ERS參與AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡可能是由AOPPs與RAGE結(jié)合后通過(guò)NADPH氧化酶依賴的ROS生成所介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞證實(shí)我們上述假設(shè),并進(jìn)一步闡明AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。研究方法1. AOPPs修飾的小鼠白蛋白(AOPPs-MSA)的制備和鑒定AOPPs-MSA的制備和鑒定參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所介紹的方法。將MSA溶液與濃度為200mmol/L的次氯酸以1/140的摩爾比例混合,室溫反應(yīng)30分鐘(25～30℃)；然后將制備的樣品在4℃無(wú)菌PBS中透析24h,以去除殘留的游離次氯酸。未經(jīng)修飾的MSA與PBS等體積混合,作為對(duì)照。制備的所有AOPPs-MSA經(jīng)Detoxi-Gel凝膠柱去除所含的內(nèi)毒素,內(nèi)毒素水平通過(guò)鱟試驗(yàn)法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè),所制備的溶液中內(nèi)毒素水平低于0.025EU/ml。AOPPs含量測(cè)定：在碘化鉀存在的條件下,以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定酸性條件下340nm處的吸光度值。AOPPs-MSA和未經(jīng)修飾的MSA中AOPPs的濃度分別為：70.2±3.41nmol/mg、0.23±0.05nmol/mg。在所有制備的樣品中均不能檢測(cè)到AGEs的成份。2.足細(xì)胞的培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞按文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所介紹的方法培養(yǎng)。將未分化的足細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清、鏈霉素(100μg/ml)、青霉素(100U/ml)、丙酮酸鈉(1mmol/L)、碳酸氫鈉(0.075%)和HEPES緩沖液(10mmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)液中。在上述培養(yǎng)基中加入10u/ml的重組小鼠□-干擾素的條件下,置于33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,使足細(xì)胞處于“允許生長(zhǎng)”的條件下生長(zhǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí),不加□-干擾素,置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)12天,使足細(xì)胞處于“限制生長(zhǎng)”的條件下誘導(dǎo)分化,用于實(shí)驗(yàn)。本研究使用的是限制生長(zhǎng)的10-18代條件性永生小鼠足細(xì)胞。在部分實(shí)驗(yàn)中足細(xì)胞用ERS誘導(dǎo)劑thapsigargin (0.25μM)處理24h。在阻斷實(shí)驗(yàn)中,在用200μg/mLAOPPs孵育足細(xì)胞24h之前分別用ERS抑制劑salubrinal (50μM)、ROS清除劑c-SOD (100U/mL)和NADPH氧化酶抑制劑DPI (10μM)預(yù)處理1h。3.實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平收集細(xì)胞,加入TRIzol試劑,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作提取總RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將總RNA逆轉(zhuǎn)到cDNA上。實(shí)時(shí)定量PCR是按照PCR SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。RT-PCR條件如下：950C2分鐘,然后95℃30秒與60℃35秒重復(fù)循環(huán)40次。所用引物的上游和下游序列分別為：β-actin 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'(forward)、 5'-AGACAGCACTGTGTTGGCAT-3'(reverse), GRP78 5'-CCTATTCCTGCGTCGGTGTG-3'(forward)、 5'-GCATCGAAGACCGTGTTCTC-3'(reverse), CHOP 5'-GGAAACGAAGAGGAAGAATC-3'(forward)、 5'-CTGGGCCATAGAACTCTGAC-3'(reverse), Bcl-2 5'-ATAACCGGGAGATCGTGATG-3'(forward)、 5'-GTTGCTCTCAGGCTGGAAGG-3'(reverse)。所有的數(shù)據(jù)以β-actin為內(nèi)參,用2-△△Ct方法分析表達(dá)水平。4.蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞置于RIPA緩沖液中裂解,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,再把PVDF膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST中,室溫下封閉2h；用兔抗小鼠PERK、IRE1、ATF6、p-PERK、p-IRE1、cleaved ATF6、 CHOP、Bcl-2、caspase-12、cleaved caspase-3和RAGE抗體(1：1000稀釋)與PVDF膜在4℃孵育過(guò)夜。再用山羊抗兔二抗與上述PVDF膜在室溫下孵育1h,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)檢測(cè)蛋白,用Total Lab2.0定量條帶密度,以β-actin為內(nèi)參。5. siRNA轉(zhuǎn)染非特異性siRNA和RAGE、PERK、IRE1和ATF6的siRNA均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。按照試劑盒說(shuō)明操作,用Lipofectamine2000將siRNA轉(zhuǎn)染到足細(xì)胞。每段基因的靶向序列分別為：RAGE 5'-GGUCAGAGCUGACAGUGAUTT-3', PERK 5'-GCAGGTCCTTGGTAATCAT-3', ATF6 5'-GCAAAGCAGCAGTCGATTA-3', IRE1 5'-CCAATGTATGTCACAGAAA-3'.非特異性siRNA為陰性對(duì)照,Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后的干擾效果。6.TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡按DeadEndTMUNEL系統(tǒng)說(shuō)明檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞置于4%的多聚甲醛中在40℃溫度下固定30分鐘,再用0.1% Triton X-100及0.1%檸檬酸鈉透化細(xì)胞,然后加入TdT酶及熒光素結(jié)合核苷酸在370C孵育60分鐘。用熒光顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記綠色熒光的凋亡細(xì)胞。用DAPI共染樣本確定細(xì)胞核以鑒別假陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。7.細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成量檢測(cè)應(yīng)用Reactive Oxygen Species Assay Kit試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量,處理后的足細(xì)胞用PBS沖洗3次后,加入10μM 2',7'-DCFH-DA置于370℃暗箱中孵育60分鐘,然后用無(wú)血清RMPI1640溶液沖洗3次。熒光檢測(cè)器檢測(cè)488-nm激發(fā)波長(zhǎng)和525-nm發(fā)射波長(zhǎng)用以定量ROS生成量。8.統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA,方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3; P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0完成。結(jié)果1.AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生ERS應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)了各組足細(xì)胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)AOPPs呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性上調(diào)了足細(xì)胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平；而空白對(duì)照組和未修飾MSA組均無(wú)明顯上調(diào),而且這兩組比較也無(wú)顯著差異,這說(shuō)明GRP78、CHOP的過(guò)度表達(dá)與MSA的晚期氧化相關(guān)的。2. AOPPs通過(guò)激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡我們應(yīng)用TUNEL的方法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。AOPPs刺激后足細(xì)胞的凋亡率較空白對(duì)照組和未修飾MSA組顯著增加,而且ERS抑制劑salubrinal可部分阻斷AOPPs的效應(yīng),而ERS激活劑thapsigargin則與AOPPs一樣顯著增加了足細(xì)胞凋亡率。3. NADPH氧化酶介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的ROS生成AOPPs刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于空白對(duì)照組及未修飾MSA組,而且NADPH氧化酶抑制劑(DPI)和ROS清除劑(c-SOD)顯著抑制了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。4. NADPH氧化酶依賴的ROS生成介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生ERS應(yīng)用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶抑制劑(DPI)和ROS清除劑(c-SOD)顯著抑制了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞GRP78和CHOP的蛋白水平表達(dá)。5.ERS參與了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞ROS生成AOPPs刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于空白對(duì)照組及未修飾MSA組,ERS抑制劑salubrinal部分阻斷了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)ROS的生成;而ERS激活劑thapsigargin則與AOPPs一樣顯著增加了足細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。6. NADPH氧化酶依賴的ROS生成介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)了DPI或c-SOD存在的情況下AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率,我們發(fā)現(xiàn)AOPPs刺激足細(xì)胞時(shí)加入DPI或c-SOD后細(xì)胞凋亡率均顯著低于單用AOPPs刺激足細(xì)胞組。7. RAGE特異性siRNA的有效性檢測(cè)分別用針對(duì)RAGE的靶向siRNA或錯(cuò)義序列無(wú)功能的scramble siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,用Western blot方法檢測(cè)兩組足細(xì)胞的RAGE蛋白表達(dá)以評(píng)估siRNA轉(zhuǎn)染有效性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAGE的siRNA組較scramble siRNA組RAGE蛋白水平顯著降低,RAGE siRNA降低RAGE蛋白表達(dá)70%。8. RAGE介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞ROS生成和ERS的發(fā)生AOPPs刺激前分別用scramble siRNA (siNC組)或RAGE siRNA (siRNA組)轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,僅用scramble siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后無(wú)AOPPs刺激作為陰性對(duì)照；檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn)siRNA組顯著低于siNC組。應(yīng)用Western blot檢測(cè)結(jié)果表明RAGE siRNA轉(zhuǎn)染后顯著阻斷了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞GRP78和CHOP的蛋白表達(dá)。9. RAGE介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞ROS生成和ERS的發(fā)生AOPPs刺激前分別用scramble siRNA (siNC組)或RAGEsiRNA (siRNA組)轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,再應(yīng)用TUNEL的方法檢測(cè)足細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn),RAGE siRNA轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞的凋亡率顯著低于scramble siRNA轉(zhuǎn)染組。10. AOPPs激活了足細(xì)胞的PERK, ATF6和IRE1三條UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路應(yīng)用Western blot險(xiǎn)測(cè)p-PERK,p-IREl和cleaved ATF6的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與未修飾MSA處理組相比較,AOPPs誘導(dǎo)了足細(xì)胞PERK, IRE1的磷酸化,并且上調(diào)了cleaved ATF6蛋白表達(dá)水平。11.PERK,ATF6和IRE1靶向siRNA的有效性檢測(cè)分別用scramble siRNA或針對(duì)PERK, ATF6和IRE1的靶向siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與scramble siRNA組相比較,分別用PERK, ATF6和IRE1的靶向siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后,均顯著下調(diào)了這三個(gè)ERS感應(yīng)蛋白的表達(dá)。12.PERK、ATF6、IRE1三條UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡AOPPs刺激前分別用scramble siRNA、PERK siRNA、ATF6 siRNA或IRE1siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。與scramble siRNA轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞相比較,分別敲除三個(gè)主要的ERS感應(yīng)蛋白均可以顯著降低足細(xì)胞的凋亡率。13.ERS參與AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡與CHOP及caspase-12依賴的促凋亡途徑相關(guān),而且Bcl-2調(diào)節(jié)CHOP介導(dǎo)的凋亡應(yīng)用Western blot和RT-PCR的方法檢測(cè)CHOP, Bcl-2, caspase-12和cleaved caspase-3的表達(dá)；與無(wú)刺激組和未修飾MSA組足細(xì)胞相比較,AOPPs刺激組足細(xì)胞CHOP, caspase-12, cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著增加,而B(niǎo)cl-2卻顯著減少；而且CHOP的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào),Bcl-2卻顯著下調(diào)；ERS抑制劑salubrinal可部分阻斷AOPPs的上述效應(yīng),相反,ERS激活劑則可產(chǎn)生與AOPPs-樣的上述效應(yīng)。結(jié)論我們的研究結(jié)果證實(shí)了AOPPs可誘導(dǎo)足細(xì)胞ERS發(fā)生,并且AOPPs通過(guò)激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。其次,本研究也表明ERS參與AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡是由AOPPs與足細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后通過(guò)NADPH氧化酶依賴的ROS生成所介導(dǎo)的。再次,三條經(jīng)典的UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:PERK,ATF6和IRE1通路,均介導(dǎo)了ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。最后,我們的研究證實(shí)兩ERS相關(guān)的凋亡途徑：CHOP-和caspase-12依賴途徑,均介導(dǎo)了ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,而且Bcl-2的抑制參與了CHOP凋亡途徑。足細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用,而且AOPPs的聚集在糖尿病腎病患者中普遍存在,因此,我們的研究從ERS角度為糖尿病腎病的治療提供了新的策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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1 王東生,袁肇凱,郭志華;細(xì)胞凋亡與中醫(yī)藥[J];中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志;2000年12期

2 萬(wàn)曉艷,于蘇國(guó),郭玉芹,何慶;細(xì)胞凋亡與自身免疫性甲狀腺疾病的研究進(jìn)展[J];中國(guó)地方病防治雜志;2002年06期

3 祝偉民,林建棣,馬曉東,段小平;運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞凋亡[J];中國(guó)臨床康復(fù);2004年27期

4 王會(huì)玲,景文莉,張小紅,高維娟;細(xì)胞凋亡與心肌缺血-再灌注損傷[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年04期

5 梁薇;細(xì)胞凋亡的中藥調(diào)節(jié)機(jī)制[J];四川中醫(yī);2005年11期

6 張松彪;細(xì)胞凋亡與細(xì)胞養(yǎng)生[J];中國(guó)科技產(chǎn)業(yè);2005年01期

7 楊竹林,伍漢文;細(xì)胞凋亡調(diào)控因素有關(guān)基因的研究[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));1997年02期

8 劉恩梅,楊錫強(qiáng);細(xì)胞凋亡及其影響因素[J];重慶醫(yī)學(xué);1998年01期

9 ;美開(kāi)發(fā)調(diào)控細(xì)胞凋亡藥物[J];中國(guó)腫瘤;1999年07期

10 管孝鞠,廖明陽(yáng);細(xì)胞凋亡在致畸中的作用[J];衛(wèi)生毒理學(xué)雜志;2000年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳穎麗;李前忠;;不同亞細(xì)胞位置的細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性分析[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

2 孫英麗;趙允;朱山;翟中和;;植物細(xì)胞凋亡及其機(jī)理的研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

3 劉二龍;袁慧;;鋅與細(xì)胞凋亡[A];2003全國(guó)家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文專輯[C];2003年

4 邱潔;高海青;;鋅在細(xì)胞凋亡中的作用研究進(jìn)展[A];山東省微量元素科學(xué)研究會(huì)第三屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

5 俞雅萍;;細(xì)胞凋亡的機(jī)制及途徑和影響因素[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

6 于青;袁偉杰;姚建;;晚期糖基化終末產(chǎn)物引起足細(xì)胞凋亡的機(jī)制[A];2007年浙滬兩地腎臟病學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2007年

7 季宇彬;尹立;汲晨鋒;;調(diào)控細(xì)胞凋亡的線粒體因素[A];腫瘤病因?qū)W研究與中西醫(yī)結(jié)合腫瘤綜合診療交流研討會(huì)論文集[C];2009年

8 吳經(jīng)緯;湯長(zhǎng)發(fā);;運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞凋亡的線粒體變化特征[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2006年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

9 蒲小平;李長(zhǎng)齡;屠鵬飛;宋志宏;;中藥肉叢蓉成分抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆全國(guó)生化藥理學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2000年

10 江鍵;宋誠(chéng)榮;崔黎麗;方影;王小平;;靜電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡作用的初步探討[A];中國(guó)物理學(xué)會(huì)第九屆靜電學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2000年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 商?hào)|;“細(xì)胞凋亡”與臨床醫(yī)學(xué)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

2 張志軍;細(xì)胞凋亡與中醫(yī)藥[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

3 ;“細(xì)胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

4 記者張建松;治療癌癥新途徑：細(xì)胞凋亡療法[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

5 李明輝;“細(xì)胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2002年

6 洪敏;細(xì)胞凋亡研究引人關(guān)注[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

7 陶春祥;細(xì)胞凋亡對(duì)心臟疾病的影響[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

8 本報(bào)實(shí)習(xí)記者 梁媛媛;薛定：發(fā)現(xiàn)癌癥“開(kāi)關(guān)”[N];北京科技報(bào);2010年

9 高書(shū)明;誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

10 勇匯;中藥誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊利;系列多氮類化合物的抗腫瘤活性研究[D];武漢大學(xué);2012年

2 張浩;從分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與機(jī)理[D];山東大學(xué);2015年

3 何欣怡;家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）抑制家蠶BmN細(xì)胞凋亡的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

4 馮全服;從線粒體途徑研究川芎嗪誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡效應(yīng)機(jī)制[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 張曉倩;高糖誘導(dǎo)Bim蛋白高表達(dá)而促腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討[D];山東大學(xué);2015年

6 孫健瑋;PTEN基因負(fù)調(diào)控Raf1磷酸化的作用及其對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

7 徐林艷;腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中TNFRSF10B和CFLAR調(diào)控機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

8 樊慶端;生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建模與動(dòng)力學(xué)行為研究[D];上海大學(xué);2015年

9 王德選;WNK_3對(duì)鈉氯協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)及在胚腎細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 葉嘉;Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 安璐;3-氯-1,2-丙二醇細(xì)胞毒性及其誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡途徑探究[D];江南大學(xué);2015年

2 楊翔;Procaspase-8的異常表達(dá)抑制TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[D];昆明理工大學(xué);2015年

3 張昌明;I3C通過(guò)調(diào)控p53泛素化對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響[D];延邊大學(xué);2015年

4 彭涵;共軛亞油酸對(duì)仔豬脂肪細(xì)胞凋亡的影響[D];西南大學(xué);2015年

5 李立輝;ΔFosB通過(guò)MMP-9調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

6 楊鑫鋮;Hedgehog信號(hào)通路在大鼠急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 賈瓊瓊;MicroRNA-214對(duì)H_2O_2損傷L6骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 王�，�;不同濃度17β-雌二醇對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 王怡;地西他濱對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡及TAL1基因表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

10 張文明;抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選及其抗腫瘤機(jī)制的研究[D];西南交通大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1682949