發(fā)布時(shí)間：2018-03-28 23:31

  本文選題：膀胱癌　切入點(diǎn)：葉綠酸f　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究目的葉綠酸f是由本課題組最近研制開(kāi)發(fā)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型光敏劑,其基本的光動(dòng)力學(xué)特性以及對(duì)膀胱癌的光動(dòng)力殺傷效果和機(jī)制尚不清楚。本研究旨在明確葉綠酸f的制備流程及其光動(dòng)力學(xué)特性,探討其介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)作用對(duì)膀胱癌細(xì)胞的體外殺傷效果及其可能的機(jī)制,為其下一步的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)理論支持。研究方法1、首先從原料中藥蠶砂中提取得到葉綠素粗制品,經(jīng)堿水解、分離、提取、純化等步驟得到純度極高的葉綠酸e6,再由葉綠酸e6制備葉綠酸f以及其對(duì)應(yīng)的鈉鹽。2、采用高壓液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析葉綠酸f樣品的純度,質(zhì)譜儀(Mass spectrometry, MS)分析葉綠酸f分子量,熒光分光光度計(jì)分析其吸收光譜,應(yīng)用1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)檢測(cè)其產(chǎn)生1O2的能力。3、體外培養(yǎng)膀胱癌5637和T24細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,然后應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的葉綠酸f在不同能量密度的650nm波長(zhǎng)激光激發(fā)下對(duì)膀胱癌5637和T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,倒置顯微鏡下觀測(cè)膀胱癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。4、將葉綠酸f與5637和T24細(xì)胞孵育4h后,再用線粒體特異性探針標(biāo)記線粒體,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope,CLSM)檢測(cè)葉綠酸f在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布；對(duì)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)治療(Photodynamic therapy, PDT)12h后的5637和T24細(xì)胞應(yīng)用DAPI染色,熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；采用流式細(xì)胞儀(Flow cytometry, FCM)分析葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理12h后5637和T24細(xì)胞的凋亡率。5、采用細(xì)胞凋亡蛋白抗體芯片技術(shù)檢測(cè)5637和T24細(xì)胞光動(dòng)力處理前后bad、bax、BID、BIM、Bc1-2、 Bc1-w、Caspase-3、Caspase-8和細(xì)胞色素C、XIAP、SMAC等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,探討葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)作用誘導(dǎo)5637和T24細(xì)胞凋亡的可能機(jī)理。6、將葉綠酸f與5637和T24細(xì)胞孵育2h后,應(yīng)用溶酶體特異性探針標(biāo)記溶酶體,激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)葉綠酸f在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布；westernb lot方法檢測(cè)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理前后5637和T24細(xì)胞中LC3, Beclinl蛋白的表達(dá)情況；分別應(yīng)用Cyto-ID(?)自噬特異性染料、單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin, MDC)、吖啶橙(Acridine Orange, AO)染料對(duì)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理后的5637和T24細(xì)胞進(jìn)行染色,然后激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TE M)下觀察葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理1h后5637和T24細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。7、應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)對(duì)5637和T24細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1h,然后給與f-PDT處理,分別采用CCK-8法以及流式細(xì)胞儀分析葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理后5637和T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率。研究結(jié)果1、制得的葉綠酸f樣品純度為90.19%,相對(duì)分子量為539.3,其吸收峰為653.5nm,599.0nm,501.5nm以及398.5nm,其中398.5nm和653.5nm處吸收峰最強(qiáng)；葉綠酸f與DPBF溶液共孵育后,采用波長(zhǎng)為405nnm,能量密度為40mW/cm2的紅光分別激發(fā)15s,30s,45s,60,75s,熒光光譜儀結(jié)果顯示DPBF的熒光強(qiáng)度隨著激光激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。2、葉綠酸f各濃度1、2和4ug/ml對(duì)5637細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在4J/cm2下分別為33.92%、57.38%和84.88%,在2J/cm2則相應(yīng)為25.4%、51.21%和70.09%,各濃度2.5ug/m1.5ug/m1.10ug/ml對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在4J/cm2下分別為34.03%、60.11%和86.51%,在2J/cm2為31.79%、53.83%和72.89%。3、5637和T24細(xì)胞先后與葉綠酸f,線粒體探針?lè)跤?激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示400nm激發(fā)葉綠酸f發(fā)出的紅色自身熒光與488nm激發(fā)線粒體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。4、熒光顯微鏡下DAPI染色結(jié)果可見(jiàn)f-PDT處理后5637和T24細(xì)胞均出現(xiàn)胞核邊緣不規(guī)則,核固縮,核溶解、碎裂,核小體碎片增加等細(xì)胞凋亡的典型特征,而空白對(duì)照組細(xì)胞則未見(jiàn)到明顯的凋亡細(xì)胞。5、5637細(xì)胞在4ug/ml葉綠酸f和4J/cm2,650nm激光條件下,光動(dòng)力處理后,行流式細(xì)胞檢測(cè),細(xì)胞凋亡率為50.61±1.66%,細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為4.05±0.12%;T24細(xì)胞在10ug/ml葉綠酸f和4J/cm2,650nm激光條件下,光動(dòng)力處理后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率為54.3±1.32%,細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為11.31±0.71%。兩種細(xì)胞中PDT處理組與細(xì)胞對(duì)照組之間差異有顯著性意義(P0.01)。6、在5637細(xì)胞PDT處理組中促凋亡蛋白bad.BID.BIM較對(duì)照組有不同程度的升高,分別為對(duì)照組的1.25倍,1.38倍和1.23倍；而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對(duì)照組則有明顯的下降,分別為對(duì)照組的0.25倍和0.48倍；處理組細(xì)胞色素C水平高于對(duì)照組,是對(duì)照組的1.32倍；Caspase3相較于處理組也有一定程度的升高,為對(duì)照組的1.35倍,Caspase8則相對(duì)于對(duì)照組無(wú)明顯改變；凋亡抑制蛋白XIAP處理組明顯低于對(duì)照組,是對(duì)照組的0.34倍；促凋亡蛋白SMAC處理組則高于對(duì)照組,為對(duì)照組的1.14倍。在T24細(xì)胞處理組中促凋亡蛋白bad.bax.BID BI M較對(duì)照組有不同程度的升高,分別為對(duì)照組的2.39倍,1.55倍,2.06倍和1.19倍；而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對(duì)照組均有一定程度的下降,分別為對(duì)照組的0.83和0.82倍;處理組細(xì)胞色素C水平高于對(duì)照組,是對(duì)照組的1.55倍；Caspase3和Caspase8處理組對(duì)比對(duì)照組均有一定程度的升高,分別為對(duì)照組的1.42倍和1.18倍；凋亡抑制蛋白XIAP處理組低于對(duì)照組,是對(duì)照組的0.82倍：促凋亡蛋白SMAC處理組高于對(duì)照組,為對(duì)照組的1.35倍。7、兩種細(xì)胞與葉綠酸f孵育2h后,再與溶酶體探針?lè)跤?激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示葉綠酸f自身的紅色熒光與504nm激發(fā)溶酶體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。8、Beclin1和LC3-II蛋白在5637和T24細(xì)胞PDT處理組中表達(dá)增高,均呈一定的時(shí)間依賴性。9、Cyto-ID(?)自噬特異性綠色染料,MDC以及AO染色后,激光共聚焦結(jié)果顯示5637和T24細(xì)胞內(nèi)在f-PDT后1h,2h和4h均先后形成自噬體(lutophagosomes),晚期自噬體以及自噬溶酶體(lutolysosomes)結(jié)構(gòu)。10、5637和T24細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)處理后,透射電鏡檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)很多雙層膜樣結(jié)構(gòu)的自噬體,其內(nèi)部可見(jiàn)到胞質(zhì)成分以及受損的細(xì)胞器。對(duì)照組無(wú)相應(yīng)改變。11、3-MA預(yù)處理+PDT處理組中5637細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為93.52%,而對(duì)應(yīng)的PDT處理組中5637細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率則為83.15%,3-MA對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為6.73%;同時(shí)3-MA預(yù)處理+PDT處理組中T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為95.51%,對(duì)應(yīng)的T24細(xì)胞PDT處理組中的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為86.19%,3-MA對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率則為5.78%。12、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,3-MA預(yù)處理+PDT處理組中5637細(xì)胞的凋亡率69.454±2.14%,而對(duì)應(yīng)的PDT處理組中5637細(xì)胞的凋亡率則為50.61±1.66%；同時(shí)3-MA預(yù)處理+PDT處理組中T24細(xì)胞的凋亡率為77.69±1.75,對(duì)應(yīng)的T24細(xì)胞PDT處理組中的細(xì)胞凋亡率為54.3±1.32%。兩種細(xì)胞中3-MA預(yù)處理+PDT處理組與PDT處理組之間差異有顯著性意義(P0.05)。研究結(jié)論1、制備的葉綠酸f純度高,光學(xué)特性符合理想光敏劑要求。2、葉綠酸f結(jié)合650nnm激光,體外光動(dòng)力作用殺傷膀胱癌5637和T24效果顯著,具有藥物劑量和激光能量依賴性。3、葉綠酸f可以定位在膀胱癌細(xì)胞溶酶體以及線粒體中,首先誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬,然后通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。4、5637和T24細(xì)胞經(jīng)PDT處理后,促凋亡蛋白bad、bax、BID、BIM等水平不同程度升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w等出現(xiàn)一定程度的下降,細(xì)胞色素C、SMAC 及 XIAP等從線粒體中被釋放入細(xì)胞漿,綜合作用激活下游的Caspase-3等分子,從而誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。5、自噬在f-PDT處理膀胱癌細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的作用,聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑與f-PDT可以進(jìn)一步提高PDT對(duì)膀胱癌的殺傷效果。
[Abstract]:A new type of photosensitizer with independent intellectual property rights was developed recently by the research team . The effect and mechanism of photodynamics on bladder cancer cells were studied by means of high performance liquid chromatography ( HPLC ) .
DAPI staining was used to observe the morphological changes of cells under fluorescence microscope after 12 hours of Photodynamic therapy ( PDT ) .
The apoptosis rate of 5637 and 24 cells was determined by flow cytometry ( FCM ) . The possible mechanism of apoptosis of 5637 and 24 cells was detected by using cell apoptosis protein antibody chip technique .
The expression of LC3 and Beclinl was detected in 5637 and 24 cells before and after photodynamic therapy with green acid f .
The cells were stained with Cyto - ID ( ? ) autophagy specific dye , monodanylpentanediamine ( MDC ) and acridine orange ( AO ) dye , then the morphological changes of cells were observed under confocal microscope .
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本文編號(hào)：1678578