本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：基因芯片　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)為男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,目前被公認(rèn)為是男性人群所面臨的最重要的醫(yī)學(xué)難題之一。在歐美國(guó)家前列腺癌是最常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤,其病例數(shù)已超過(guò)肺癌和大腸癌,成為第1位危害男性健康的腫瘤。就全球范圍來(lái)看,我國(guó)目前雖然處在前列腺癌低發(fā)地區(qū),但據(jù)保守估計(jì)：我國(guó)前列腺癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均將呈上升趨勢(shì)。至2030年,發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)的上升幅度達(dá)106.4%和111.4%,平均每年上升4.8%和5.1%。上海市統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示前列腺癌已從1991年的29/10萬(wàn)男性(標(biāo)化率24/10萬(wàn))上升到2001年的1214/10萬(wàn)男性(標(biāo)化率678/10萬(wàn))。所以從現(xiàn)階段開(kāi)始,深入研究前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及疾病轉(zhuǎn)歸規(guī)律,對(duì)前列腺癌的預(yù)防及治療具有重大的科研和臨床意義。 目前有關(guān)前列腺癌的病因及致病機(jī)制仍不十分清楚,相關(guān)癌基因的異常激活及其表達(dá)產(chǎn)物在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程之中起重要作用。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)由多基因參與,多階段逐漸演變的過(guò)程；一直以來(lái),基因組的改變被認(rèn)為加速了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中,這種基因組的改變與腫瘤發(fā)生的早晚期事件相關(guān)。遺傳因素是前列腺癌發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素,因此：前列腺癌的遺傳學(xué)研究有助于為前列腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供數(shù)據(jù)和尋找中國(guó)人群特異性的前列腺癌標(biāo)記物。研究表明8號(hào)染色體與前列腺癌有關(guān),8號(hào)染色體短臂的缺失被認(rèn)為是前列腺癌的早期事件,見(jiàn)于前列腺上皮內(nèi)腫瘤及幾乎所有的前列腺癌中。但是,近年來(lái)8號(hào)染色體長(zhǎng)臂8q的擴(kuò)增尤其是(8q21-24區(qū)域)被認(rèn)為與前列腺癌的發(fā)生及侵潤(rùn)性進(jìn)展有關(guān)。研究前列腺癌8號(hào)染色體上基因異常擴(kuò)增的改變情況,尋找前列腺癌潛在的候選癌基因,并研究這些基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的變化和作用機(jī)制對(duì)于揭示前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理以及臨床診斷分子靶標(biāo)有重要意義。 基因芯片是在90年代中期發(fā)展出來(lái)的高科技產(chǎn)物,大小如指甲蓋一般,每個(gè)芯片的基面上都可劃分出數(shù)萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)個(gè)小區(qū)。在指定的小區(qū)內(nèi),可固定大量具有特定功能、長(zhǎng)約20個(gè)堿基序列的分子探針。由于被固定的分子探針在基質(zhì)上形成不同的探針陣列,利用分子雜交及平行處理原理,基因芯片可對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)。因此可用于進(jìn)行基因研究、法醫(yī)鑒定、疾病檢測(cè)、藥物篩選、癌癥的精確認(rèn)斷及治療；此外還能對(duì)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸進(jìn)行預(yù)測(cè)。傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法只能針對(duì)某一基因進(jìn)行研究,而基因芯片可以一次性檢測(cè)和分析成千上萬(wàn)種腫瘤相關(guān)基因,有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)理,在泌尿系腫瘤的診斷、治療方面的應(yīng)用有著廣泛的前景。 本研究亦通過(guò)基因芯片在前列腺癌和癌旁良性組織中篩選前列腺癌8號(hào)染色體上調(diào)表達(dá)的基因,分析這些基因的生物信息行為；再結(jié)合MILANO網(wǎng)站篩選8q21-24區(qū)域上調(diào)表達(dá)基因,驗(yàn)證篩選基因在前列腺癌細(xì)胞和組織中基因表達(dá),擴(kuò)增和蛋白表達(dá)情況。研究這些異常表達(dá)基因及其相關(guān)蛋白與前列腺癌臨床病理之間的相關(guān)聯(lián)系,比較篩選基因分子和臨床水平生物學(xué)行為的異同,以期望在8q21-24區(qū)域能尋找到新的與前列腺癌發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)的潛在腫瘤標(biāo)記物。 研究材料： 1：用于基因芯片檢測(cè)和候選癌基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前列腺癌和良性前列腺組織均為在我院住院的患者中收集。4例癌-癌旁組織標(biāo)本送芯片檢測(cè)。另外用于候選基因驗(yàn)證的前列腺癌標(biāo)本10例,患者平均年齡73.9歲,PSA≥4有9例,Gleason≥8有6例。 2：前列腺癌PC3/DU145/LNCap細(xì)胞系和永生化的前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1為我院實(shí)驗(yàn)室保存。 3：免疫組化實(shí)驗(yàn)的前列腺癌組織芯片標(biāo)本購(gòu)買于美國(guó)Creative Bioarray公司。共100例前列腺癌標(biāo)本,平均年齡68.1歲、PSA≥4的有90例、Gleason≥8的有27例。 研究方法： 1：收集我院住院患者的4對(duì)前列腺癌及其癌旁臨床組織樣本,通過(guò)激光顯微切割獲取較純凈的癌和癌旁組織。提取并純化樣本組織的總RNA用作基因芯片雜交、通過(guò)Agilent基因芯片作RNA檢測(cè)、分析芯片數(shù)據(jù),篩選出差異表達(dá)基因。根據(jù)基因芯片分析結(jié)果結(jié)合Agilent軟件分析,表達(dá)倍數(shù)高于1.5倍的基因被認(rèn)為是高表達(dá)的基因。在8號(hào)染色體上癌組織與癌旁組織相比,篩選出高表達(dá)的基因。 2：通過(guò)基因芯片數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站Panther聚類分析8號(hào)染色體上調(diào)表達(dá)基因的生物學(xué)行為；String網(wǎng)站分析篩選蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。 3：通過(guò)MILANO網(wǎng)站分析,整合8號(hào)染色體8q21-24區(qū)域。將8號(hào)染色體差異表達(dá)的基因輸入Primary Search Term框內(nèi),然后將Oncogene和Cancer輸入到Secondary Search Term框內(nèi),搜索Pubmed整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到最終的上調(diào)表達(dá)基因列表。 4：收集的10例前列腺癌和10例良性前列腺組織標(biāo)本及前列腺癌PC3/DU145/LNCaP細(xì)胞系對(duì)8q21-24區(qū)域候選基因行mRNA RT-qPCR檢測(cè),以驗(yàn)證候選基因在前列腺癌和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,是否符合表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。 5：對(duì)mRNA驗(yàn)證符合表達(dá)譜數(shù)據(jù)的基因,再通過(guò)DNA-qPCR方法檢測(cè)10例前列腺癌和良性前列腺組織標(biāo)本及前列腺癌PC3/DU145/LNCaP細(xì)胞系候選基因DNA拷貝數(shù)改變情況。 6:Western blot驗(yàn)證候選蛋白在10例前列腺癌和良性組織表達(dá)的差異情況。 7：大樣本組織芯片免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選蛋白在前列腺癌和良性組織中表達(dá)的差異情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以”x±s”表示,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析候選癌基因和蛋白在前列腺癌和良性組織之中的差異表達(dá)情況,方差不齊則采用t’檢驗(yàn)。多組均數(shù)間比較用one-way ANOVA分析,組間比較用LSD分析。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較候選蛋白在前列腺癌和良性組織中染色強(qiáng)度變化,Pearson卡方檢驗(yàn)分析候選蛋白在前列腺癌組織中的免疫組化評(píng)分與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)資料P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1：表達(dá)譜基因芯片Whole Human Genome Microarray(4x44K)(Agilent)檢測(cè)4組配對(duì)前列腺癌和癌旁組織的基因差異表達(dá)情況,在前列腺癌8號(hào)染色體共篩選出上調(diào)表達(dá)1.5倍的基因21個(gè)(GHLHE22、C8orf38、C8orf51、CTHRC1、 DSCC1、E2F5、FAM49B、FAM86B2、hCG-19905、INTS8、LOC389641、MTFR1、 MYC、OSGIN2、PAG1、PBK、POLB、TMEM65、TNFRSF19A、UBXN2B、 ZMAT4。 2：8號(hào)染色體上調(diào)表達(dá)基因涉及多種分子水平生物學(xué)行為,E2F5和MYC兩個(gè)基因分子水平生物學(xué)行為相似度較高(都屬于結(jié)合類因子,都具有細(xì)胞調(diào)控作用,都屬于轉(zhuǎn)錄因子蛋白和細(xì)胞核蛋白成分；E2F5和MYC，DSCC1和PBK蛋白之間有相互作用。 3：整合8q21-24區(qū)域最后確定上調(diào)表達(dá)的6個(gè)基因:CTHRC1、PAG1、FAM49B、 TMEM65、MYC、E2F5。 4：在10例前列腺癌和良性組織中,E2F5及MYC基因的在前列腺癌組織中表達(dá)一致性顯著高于良性組織(P0.05)；PAG1、FAM49B、TMEM65在前列腺癌中的表達(dá)也高于良性組織(P0.05)。在細(xì)胞系方面：E2F5在3個(gè)前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)均高于永生化的前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1(P0.01),而MYC在LNCap和Du145細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于永生化的前列腺上皮細(xì)胞(P0.01),在PC3細(xì)胞中表達(dá)卻不明顯；CTHRC1在PC3和DU145中的表達(dá)相比正常細(xì)胞差異明顯(P0.01);PAG1和TMEM65在DU145以及LNCap中的表達(dá)相比正常細(xì)胞差異明顯(P0.01)。 5： E2F5在前列腺癌中基因拷貝數(shù)明顯高于良性組織(P0.001),在PC3和LNCap細(xì)胞系中基因拷貝數(shù)高于正常的永生化前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(P0.01),但是在DU145細(xì)胞系中基因拷貝數(shù)無(wú)明顯變化。MYC在前列腺癌中基因拷貝數(shù)明顯高于良性組織(P0.001),細(xì)胞系方面在LNCap細(xì)胞系中基因拷貝數(shù)高于正常的永生化前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(P0.01)。 6:Western blot結(jié)果表明E2F5及MYC蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)均高于良性組織(P0.001)。 7：免疫組化結(jié)果顯示E2F5和MYC蛋白在前列腺癌組織中表達(dá)增加(P0.001)。而且,E2F5的過(guò)表達(dá)與高的臨床分期(P0.001)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)移(P0.001相關(guān)；MYC的過(guò)表達(dá)與陽(yáng)性轉(zhuǎn)移(P0.001)相關(guān)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用基因芯片篩選前列腺癌腫瘤標(biāo)記物是一種行之有效的方法。 2.定位于染色體8q21-24區(qū)域PAG1、FAM49B、TMEM65這3個(gè)基因表達(dá)增加可能與前列腺癌有關(guān)。 3.定位于染色體8q21-24區(qū)域的E2F5和MYC基因在前列腺癌組織和細(xì)胞中均表達(dá)增加,并且和前列腺癌的臨床分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 4. E2F5、MYC在前列腺癌中基因拷貝數(shù)增加,說(shuō)明這兩個(gè)基因在前列腺癌的遺傳發(fā)病中起一定作用。 5.E2F5和MYC分子水平和臨床水平生物學(xué)行為較為一致,推測(cè)二者協(xié)同作用在前列腺癌的遺傳發(fā)病和臨床進(jìn)展中起重要作用,E2F5和MYC可作為前列腺癌潛在癌基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

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