本文選題：腎移植　切入點：急性排斥反應　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景:腎移植是終末期腎功能衰竭目前最佳的治療方法,是二十世紀生命科學領域具有代表性的重大成就,也是今后終末期腎病治療的主要方向之一。新型免疫抑制劑的開發(fā)和應用,外科手術技術的改良和護理的精心加強,使移植病人和移植腎臟的存活在近十年來有了顯著的提高。但腎移植術后急性排斥反應的發(fā)生與反復發(fā)作使移植腎功能損傷;而目前,腎移植術后急性排斥反應的診斷尚缺乏敏感高效的特異指標,臨床難以及時防治,最終導致移植腎功能損害。所以,尋求早期監(jiān)測診斷方法,對保護和延長移植腎功能,至關重要。移植腎活檢是診斷腎移植術后急性排斥反應的金標準。但在病理作出急性排斥反應診斷的同時,移植腎已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的損傷,其功能也已經(jīng)受到了影響。為能更早期地發(fā)現(xiàn)亞臨床急性排斥反應,學者們提出腎移植術后移植腎定期序貫穿刺活檢。移植腎穿刺是一種有創(chuàng)的檢查方法,伴隨一定程度的并發(fā)癥,對于已出院病人行移植腎穿刺活檢更是非常困難。因此,尋找一種無創(chuàng)、新型、高敏感性和特異性的前期預警診斷方法,成為國際移植界關注的焦點。而有學者提出急性排斥反應的發(fā)生是一個時間連續(xù)性的統(tǒng)一事件,當急性排斥反應發(fā)生初期僅出現(xiàn)某些特定分子的微小改變時,就及時對腎移植患者進行早期干預,可望有效阻止移植腎的進一步損傷。所以,在腎移植術后早期進行分子監(jiān)測是一項重要的策略。趨化因子是一類包含4個保守半胱氨酸殘基,具有化學趨化功能的多肽,其分子量多在8-12kDa之間。根據(jù)第1及第2個半胱氨酸之間所含其它氨基酸的的結(jié)構(gòu)特點,可劃分為4個亞族,分別為C、CC、CX3C、及CXC。趨化因子的主要作用是吸引免疫細胞到達免疫應答局部,參與免疫調(diào)節(jié)以及病理反應。IFN-γ誘導的單核因子(CXCL9/MIG)和IFN-γ誘導的10kDa的蛋白(CXCL10/IP-10)均為趨化因子CXC亞族的一員,二者均屬于ELR-型趨化因子,是一種重要的血管穩(wěn)定因子,在體內(nèi)外均被證明有抑制血管生成作用。CXCL9可以反應炎癥前期狀態(tài),可能是預警移植并發(fā)癥的發(fā)生的有價值的標記物。而CXCL10在炎癥等生物學過程中起重要作用,且是在同種異體腎移植術后檢測到的第一個配體。CXCL9和CXCL10在干擾素γ信號通路中處于下游并吸引CXC類趨化因子受體3(CXCR3+)T細胞進入移植物,其對T淋巴細胞的募集效應可能在急性排斥反應發(fā)展過程中起關鍵作用,且通過不斷循環(huán)產(chǎn)生放大其效應,二者的受體CXCR3和TH1 T細胞活化緊密相關并被證明對移植排斥有很高的預警價值。此外,國外有學者報道CXCL9和CXCL10可能與最早期急性排斥反應的發(fā)生有關聯(lián)。由此可見,CXCL9和CXCL10可能是腎移植術后急性排斥反應容易監(jiān)測的理想生物標記物。由于趨化因子在急性排斥反應時期驅(qū)動免疫細胞分化、遷移和增殖中的起到了關鍵作用,因此其在血液循環(huán)的水平和移植受者的免疫狀態(tài)嚴密相關。國外有學者提出在確立術后血清中結(jié)合CXCR3的趨化因子在移植結(jié)局預測價值方面及外周血趨化因子表達在腎移植排斥反應中的價值有待研究。血清CXCL9、CXCL10在腎移植急性排斥反應前期可能起關鍵作用,其不但可能具有很高的診斷價值,更有可能成為急性排斥反應前期理想的干預靶點。而目前腎移植術后血清CXCL9和CXCL10水平與腎移植術后急性排斥反應的關系仍缺乏研究。在生物標記物的檢測中,分析的客觀、具有可驗證性及統(tǒng)一的標準是很重要的。由于當前進行具有這些特性的人群大樣本分析尚不能做到,這就提示我碩士學位論文們進行一定數(shù)量的動物模型實驗對血清CXCL9和CXCL10在腎移植急性排斥反應中的作用進行研究是有必要的。而我們在前期工作中已成功建立大鼠、兔腎移植與大鼠肝、腎、胰器官簇移植的動物模型,并證實了 CD44是早期診斷急性排斥反應的預測因子,動態(tài)監(jiān)測CD3、CD69、CD25及CD71的表達有助于急性排斥的早期診斷和鑒別診斷等。目的:本研究關注于CXCL9和CXCL10在腎移植術后急性排斥反應大鼠血清中的表達及意義。通過改良方法成功建立大鼠腎移植急性排斥反應模型,選擇移植腎臟進行病理學評分和診斷,并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法對腎移植術后急性排斥反應大鼠血清CXCL9和CXCL10水平進行檢測以期能夠為腎移植術后急性排斥反應發(fā)生前期的診斷研究提供可選的生物標記物。方法:一、大鼠腎移植急性排斥反應模型的建立1.動物分組健康雄性Brown Norway(BN)和Lewis近交系大鼠,體質(zhì)量為200-250g,隨機分為兩組:①異基因移植組為急性排斥組(ARx,n=15),BN大鼠為供體,Lewis大鼠為受體;②同基因移植組為對照組(con,n=15),供受體均為Lewis大鼠。動物飼養(yǎng)于空調(diào)恒溫動物房,室溫控制在20～25℃,大鼠自行飲水進食,保持24小時正常晝夜節(jié)律,飼養(yǎng)適應環(huán)境一周后開始實驗。2.手術方式大鼠腎動脈吻合采用端-側(cè)連續(xù)縫合;腎靜脈采用端-端一側(cè)靜脈壁采取連續(xù)縫合,另一側(cè)采用間斷縫合;輸尿管采用帶有膀胱瓣的供體輸尿管與受體膀胱進行連續(xù)縫合,在供、受體左側(cè)進行同種異體原位腎移植手術。術后觀察大鼠一般狀態(tài),包括精神狀態(tài)、飲食活動情況、體重變化、大便性狀等,手術成功的大鼠在術后第一天精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),可自由飲水,活動性好,對外界刺激反應較靈敏,應預防術后并發(fā)癥的發(fā)生,存活超過3天認為手術成功。二、腎移植急性排斥反應大鼠血清中趨化因子CXCL9和CXCL10表達1.樣品采集于術后3、5、7天分別處死5只大鼠,切取移植腎。每只經(jīng)腹主動脈取血6-10ml,4000 rpm離心10 min后,取0.3ml血清做肌酐(Cr)檢測,余下血清-80℃凍存待檢。2.移植腎組織學檢查移植腎組織放入10%中性福爾馬林溶液固定,連續(xù)切片(3μm)后做HE染色,移植腎病理診斷參考banff97標準并對急性排斥反應嚴重程度進行半定量評分(0=正常,1=交界性改變,2=ⅠA,3=ⅠB,4=ⅡA,5=ⅡB,6=Ⅲ)。3.血清 CXCL9、CXCL10 檢測采用ELISA方法檢測血清CXCL9、CXCL10表達,按說明書進行操作,,最后在450 nm條件下讀取OD值,利用專業(yè)標準曲線制作軟件"Curve Exert 1.4"計算樣本濃度,所有樣本均做復孔檢測。結(jié)果:1.大鼠腎移植急性排斥反應模型的建立共進行大鼠同種異體腎移植手術45次,成功率達86.7%。其中死亡6只,分別為麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低體溫2只。動脈吻合時間(15±1.5)min,靜脈吻合時間(15±1)min,總時間(30±2)min。2.病理變化半定量評分顯示ARx組和con組第3、5、7天急性排斥反應嚴重程度差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。con組第3、5、7天的半定量評分彼此均無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05);在ARx組,第3天的半定量評分與第5、7天均有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),而第5天與第7天的半定量評分無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。根據(jù)半定量評分平均數(shù)比較ARx組第3、5、7天分別發(fā)生輕、中、重度排斥,對照組無明顯排斥現(xiàn)象。3.腎移植術后血肌酐變化ARx組第3、5、7天血Cr表達持續(xù)升高,各不同時間組之間表達均有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05);與對照組比較差異均具有顯著性(P0.01)。4.腎移植術后大鼠血清CXCL10表達ARx組第3、5、7天血清CXCL10表達持續(xù)升高,第5天和第7天比較具有顯著統(tǒng)計學差異((P0.05),第3天和第5天差異無顯著性(P0.05);與對照組比較第3、5、7天血清CXCL10表達差異均具有顯著性(P0.01)。5.腎移植術后大鼠血清CXCL9表達ARx組第3、5、7天血清CXCL9表達與對照組比較顯著升高(P0.01);ARx組血清CXCL9表達不顯示呈升高趨勢,第3天、第5天分別于第7天比較具有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),第3天和第5天差異無顯著性(P0.05);第7天血清CXCL9表達較第3天和第5天顯著降低。結(jié)論:1.大鼠腎移植急性排斥反應模型的建立采用腎靜脈端端吻合,供腎帶有腹主動脈的腎動脈與腹主動脈的端側(cè)吻合及帶有膀胱瓣的輸尿管膀胱吻合的方法可成功建立大鼠腎移植急性排斥模型。這種改良術式簡單、穩(wěn)定,易被初學者掌握學習。2.腎移植術后血清中CXCL9和CXCL10表達與急性排斥反應發(fā)生關系密切,可能對急性排斥反應發(fā)生具有早期診斷價值。3.CXCL9和CXCL10在急性排斥反應發(fā)生發(fā)展過程中起共調(diào)因子作用,其表達可能呈現(xiàn)相互抵抗、互相平衡的典型趨勢的改變,這為非侵襲聯(lián)合監(jiān)測方式診斷腎移植術后急性排斥反應發(fā)生提供了新的思路。
[Abstract]:Abstract : Renal transplantation is one of the most important therapeutic methods in the field of renal transplantation . It is an important strategy for the diagnosis of acute rejection after renal transplantation . The study of serum CXCL9 and CXCL10 in acute rejection after renal transplantation has been successfully established in the early stage of renal transplantation . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA . The results were as follows : 1 . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA .

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R699.2

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本文編號：1673963