本文選題：腎移植　切入點(diǎn)：急性排斥反應(yīng)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景:腎移植是終末期腎功能衰竭目前最佳的治療方法,是二十世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域具有代表性的重大成就,也是今后終末期腎病治療的主要方向之一。新型免疫抑制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,外科手術(shù)技術(shù)的改良和護(hù)理的精心加強(qiáng),使移植病人和移植腎臟的存活在近十年來(lái)有了顯著的提高。但腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生與反復(fù)發(fā)作使移植腎功能損傷;而目前,腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的診斷尚缺乏敏感高效的特異指標(biāo),臨床難以及時(shí)防治,最終導(dǎo)致移植腎功能損害。所以,尋求早期監(jiān)測(cè)診斷方法,對(duì)保護(hù)和延長(zhǎng)移植腎功能,至關(guān)重要。移植腎活檢是診斷腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。但在病理作出急性排斥反應(yīng)診斷的同時(shí),移植腎已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的損傷,其功能也已經(jīng)受到了影響。為能更早期地發(fā)現(xiàn)亞臨床急性排斥反應(yīng),學(xué)者們提出腎移植術(shù)后移植腎定期序貫穿刺活檢。移植腎穿刺是一種有創(chuàng)的檢查方法,伴隨一定程度的并發(fā)癥,對(duì)于已出院病人行移植腎穿刺活檢更是非常困難。因此,尋找一種無(wú)創(chuàng)、新型、高敏感性和特異性的前期預(yù)警診斷方法,成為國(guó)際移植界關(guān)注的焦點(diǎn)。而有學(xué)者提出急性排斥反應(yīng)的發(fā)生是一個(gè)時(shí)間連續(xù)性的統(tǒng)一事件,當(dāng)急性排斥反應(yīng)發(fā)生初期僅出現(xiàn)某些特定分子的微小改變時(shí),就及時(shí)對(duì)腎移植患者進(jìn)行早期干預(yù),可望有效阻止移植腎的進(jìn)一步損傷。所以,在腎移植術(shù)后早期進(jìn)行分子監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)重要的策略。趨化因子是一類包含4個(gè)保守半胱氨酸殘基,具有化學(xué)趨化功能的多肽,其分子量多在8-12kDa之間。根據(jù)第1及第2個(gè)半胱氨酸之間所含其它氨基酸的的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可劃分為4個(gè)亞族,分別為C、CC、CX3C、及CXC。趨化因子的主要作用是吸引免疫細(xì)胞到達(dá)免疫應(yīng)答局部,參與免疫調(diào)節(jié)以及病理反應(yīng)。IFN-γ誘導(dǎo)的單核因子(CXCL9/MIG)和IFN-γ誘導(dǎo)的10kDa的蛋白(CXCL10/IP-10)均為趨化因子CXC亞族的一員,二者均屬于ELR-型趨化因子,是一種重要的血管穩(wěn)定因子,在體內(nèi)外均被證明有抑制血管生成作用。CXCL9可以反應(yīng)炎癥前期狀態(tài),可能是預(yù)警移植并發(fā)癥的發(fā)生的有價(jià)值的標(biāo)記物。而CXCL10在炎癥等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用,且是在同種異體腎移植術(shù)后檢測(cè)到的第一個(gè)配體。CXCL9和CXCL10在干擾素γ信號(hào)通路中處于下游并吸引CXC類趨化因子受體3(CXCR3+)T細(xì)胞進(jìn)入移植物,其對(duì)T淋巴細(xì)胞的募集效應(yīng)可能在急性排斥反應(yīng)發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用,且通過(guò)不斷循環(huán)產(chǎn)生放大其效應(yīng),二者的受體CXCR3和TH1 T細(xì)胞活化緊密相關(guān)并被證明對(duì)移植排斥有很高的預(yù)警價(jià)值。此外,國(guó)外有學(xué)者報(bào)道CXCL9和CXCL10可能與最早期急性排斥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。由此可見(jiàn),CXCL9和CXCL10可能是腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)容易監(jiān)測(cè)的理想生物標(biāo)記物。由于趨化因子在急性排斥反應(yīng)時(shí)期驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞分化、遷移和增殖中的起到了關(guān)鍵作用,因此其在血液循環(huán)的水平和移植受者的免疫狀態(tài)嚴(yán)密相關(guān)。國(guó)外有學(xué)者提出在確立術(shù)后血清中結(jié)合CXCR3的趨化因子在移植結(jié)局預(yù)測(cè)價(jià)值方面及外周血趨化因子表達(dá)在腎移植排斥反應(yīng)中的價(jià)值有待研究。血清CXCL9、CXCL10在腎移植急性排斥反應(yīng)前期可能起關(guān)鍵作用,其不但可能具有很高的診斷價(jià)值,更有可能成為急性排斥反應(yīng)前期理想的干預(yù)靶點(diǎn)。而目前腎移植術(shù)后血清CXCL9和CXCL10水平與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的關(guān)系仍缺乏研究。在生物標(biāo)記物的檢測(cè)中,分析的客觀、具有可驗(yàn)證性及統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)是很重要的。由于當(dāng)前進(jìn)行具有這些特性的人群大樣本分析尚不能做到,這就提示我碩士學(xué)位論文們進(jìn)行一定數(shù)量的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)對(duì)血清CXCL9和CXCL10在腎移植急性排斥反應(yīng)中的作用進(jìn)行研究是有必要的。而我們?cè)谇捌诠ぷ髦幸殉晒⒋笫�、兔腎移植與大鼠肝、腎、胰器官簇移植的動(dòng)物模型,并證實(shí)了 CD44是早期診斷急性排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD3、CD69、CD25及CD71的表達(dá)有助于急性排斥的早期診斷和鑒別診斷等。目的:本研究關(guān)注于CXCL9和CXCL10在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)大鼠血清中的表達(dá)及意義。通過(guò)改良方法成功建立大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型,選擇移植腎臟進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分和診斷,并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法對(duì)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)大鼠血清CXCL9和CXCL10水平進(jìn)行檢測(cè)以期能夠?yàn)槟I移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生前期的診斷研究提供可選的生物標(biāo)記物。方法:一、大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型的建立1.動(dòng)物分組健康雄性Brown Norway(BN)和Lewis近交系大鼠,體質(zhì)量為200-250g,隨機(jī)分為兩組:①異基因移植組為急性排斥組(ARx,n=15),BN大鼠為供體,Lewis大鼠為受體;②同基因移植組為對(duì)照組(con,n=15),供受體均為L(zhǎng)ewis大鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)于空調(diào)恒溫動(dòng)物房,室溫控制在20～25℃,大鼠自行飲水進(jìn)食,保持24小時(shí)正常晝夜節(jié)律,飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。2.手術(shù)方式大鼠腎動(dòng)脈吻合采用端-側(cè)連續(xù)縫合;腎靜脈采用端-端一側(cè)靜脈壁采取連續(xù)縫合,另一側(cè)采用間斷縫合;輸尿管采用帶有膀胱瓣的供體輸尿管與受體膀胱進(jìn)行連續(xù)縫合,在供、受體左側(cè)進(jìn)行同種異體原位腎移植手術(shù)。術(shù)后觀察大鼠一般狀態(tài),包括精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)情況、體重變化、大便性狀等,手術(shù)成功的大鼠在術(shù)后第一天精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),可自由飲水,活動(dòng)性好,對(duì)外界刺激反應(yīng)較靈敏,應(yīng)預(yù)防術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生,存活超過(guò)3天認(rèn)為手術(shù)成功。二、腎移植急性排斥反應(yīng)大鼠血清中趨化因子CXCL9和CXCL10表達(dá)1.樣品采集于術(shù)后3、5、7天分別處死5只大鼠,切取移植腎。每只經(jīng)腹主動(dòng)脈取血6-10ml,4000 rpm離心10 min后,取0.3ml血清做肌酐(Cr)檢測(cè),余下血清-80℃凍存待檢。2.移植腎組織學(xué)檢查移植腎組織放入10%中性福爾馬林溶液固定,連續(xù)切片(3μm)后做HE染色,移植腎病理診斷參考banff97標(biāo)準(zhǔn)并對(duì)急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度進(jìn)行半定量評(píng)分(0=正常,1=交界性改變,2=ⅠA,3=ⅠB,4=ⅡA,5=ⅡB,6=Ⅲ)。3.血清 CXCL9、CXCL10 檢測(cè)采用ELISA方法檢測(cè)血清CXCL9、CXCL10表達(dá),按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,,最后在450 nm條件下讀取OD值,利用專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作軟件"Curve Exert 1.4"計(jì)算樣本濃度,所有樣本均做復(fù)孔檢測(cè)。結(jié)果:1.大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型的建立共進(jìn)行大鼠同種異體腎移植手術(shù)45次,成功率達(dá)86.7%。其中死亡6只,分別為麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低體溫2只。動(dòng)脈吻合時(shí)間(15±1.5)min,靜脈吻合時(shí)間(15±1)min,總時(shí)間(30±2)min。2.病理變化半定量評(píng)分顯示ARx組和con組第3、5、7天急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。con組第3、5、7天的半定量評(píng)分彼此均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在ARx組,第3天的半定量評(píng)分與第5、7天均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而第5天與第7天的半定量評(píng)分無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。根據(jù)半定量評(píng)分平均數(shù)比較ARx組第3、5、7天分別發(fā)生輕、中、重度排斥,對(duì)照組無(wú)明顯排斥現(xiàn)象。3.腎移植術(shù)后血肌酐變化ARx組第3、5、7天血Cr表達(dá)持續(xù)升高,各不同時(shí)間組之間表達(dá)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與對(duì)照組比較差異均具有顯著性(P0.01)。4.腎移植術(shù)后大鼠血清CXCL10表達(dá)ARx組第3、5、7天血清CXCL10表達(dá)持續(xù)升高,第5天和第7天比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異((P0.05),第3天和第5天差異無(wú)顯著性(P0.05);與對(duì)照組比較第3、5、7天血清CXCL10表達(dá)差異均具有顯著性(P0.01)。5.腎移植術(shù)后大鼠血清CXCL9表達(dá)ARx組第3、5、7天血清CXCL9表達(dá)與對(duì)照組比較顯著升高(P0.01);ARx組血清CXCL9表達(dá)不顯示呈升高趨勢(shì),第3天、第5天分別于第7天比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),第3天和第5天差異無(wú)顯著性(P0.05);第7天血清CXCL9表達(dá)較第3天和第5天顯著降低。結(jié)論:1.大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型的建立采用腎靜脈端端吻合,供腎帶有腹主動(dòng)脈的腎動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈的端側(cè)吻合及帶有膀胱瓣的輸尿管膀胱吻合的方法可成功建立大鼠腎移植急性排斥模型。這種改良術(shù)式簡(jiǎn)單、穩(wěn)定,易被初學(xué)者掌握學(xué)習(xí)。2.腎移植術(shù)后血清中CXCL9和CXCL10表達(dá)與急性排斥反應(yīng)發(fā)生關(guān)系密切,可能對(duì)急性排斥反應(yīng)發(fā)生具有早期診斷價(jià)值。3.CXCL9和CXCL10在急性排斥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起共調(diào)因子作用,其表達(dá)可能呈現(xiàn)相互抵抗、互相平衡的典型趨勢(shì)的改變,這為非侵襲聯(lián)合監(jiān)測(cè)方式診斷腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生提供了新的思路。
[Abstract]:Abstract : Renal transplantation is one of the most important therapeutic methods in the field of renal transplantation . It is an important strategy for the diagnosis of acute rejection after renal transplantation . The study of serum CXCL9 and CXCL10 in acute rejection after renal transplantation has been successfully established in the early stage of renal transplantation . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA . The results were as follows : 1 . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R699.2

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本文編號(hào)：1673963