本文選題：糖尿病腎病　切入點：金屬硫蛋白　出處：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的：本課題擬建立1型糖尿病大鼠模型，測定大鼠腎組織中氧化應激指標丙二醛（MDA）含量及總抗氧化能力（T-AOC）活性，應用免疫組織化學、反轉錄PCR等方法檢測腎組織的Nrf2、Trx表達情況，并給予金屬硫蛋白（metallothionein,MT)干預，探討糖尿病大鼠腎臟是否存在氧化應激狀態(tài)及金屬硫蛋白的干預效果，以其延緩腎損傷的發(fā)生發(fā)展。為人類糖尿病腎臟損傷的防治提供試驗性的理論依據。 糖尿病時機體處于氧化應激狀態(tài)，其脂質過氧化產物增多，細胞抗氧化能力下降。Nrf2-ARE通路是機體最重要的抗氧化應激通路之一。核因子EF-E2相關因子（Nrf2）在受到活性氧(ROS)的刺激時通過與ARE作用元件相結合，啟動下游保護性基因蛋白轉錄，其中包括硫氧還蛋白（Trx）、醌氧化還原酶（NQO1）、血紅素氧合酶1(heine oxygen ase1，HO-1)等，提高機體抗氧化能力，減少氧化應激損傷。 方法：選擇SPF級雄性大鼠48只，體重約180~220g，（購自河北醫(yī)科大學動物中心），先適應性喂養(yǎng)1周后，空腹12小時，隨機分為正常對照組(NC組，n=12)、糖尿病模型組(DM組，n=12)、糖尿病金屬硫蛋白高劑量治療組(MTH組，n=12)、糖尿病金屬硫蛋白低劑量治療組(MTL組，n=12)。其中DM組、MTH組、MTL組大鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素(65mg/k g)制備糖尿病大鼠模型, NC組則給予等量的檸檬酸緩沖液。72h后檢測血糖，血糖≥16.7mmol/L視為糖尿病模型制備成功。MTH組大鼠給予0.5mg／k g MT灌胃，MTL組大鼠給予0.1mg／k g MT灌胃，NC組、DM組每天給予等量的生理鹽水灌胃。分別于造模成功后6周、12周末，每組任取6只大鼠，測定24h尿蛋白(24hUP)、血肌酐、尿素氮。并收集腎組織標本，制作組織切片，在顯微鏡下觀察蘇木素伊紅（HE）染色及糖原染色（PAS）的大鼠腎組織病理變化，檢測腎臟丙二醛(MDA)含量、T-AOC活性，免疫組化方法檢測Nrf2、Trx的表達，RT-PCR法檢測Nrf2、TrxmRNA表達。實驗所得數(shù)據用均數(shù)±標準差(x±S)表示，應用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據進行單因素方差分析，不滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據資料采用非參數(shù)檢驗，以p0.05有統(tǒng)計學意義。 結果： 1一般狀況：DM組、MT組大鼠在注射STZ后逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿，反應遲緩，且體重逐漸下降，毛發(fā)失去光澤，其中DM組癥狀明顯重于MT組，而NC組大鼠生長發(fā)育良好，反應靈敏，飲食正常。 2生化指標 2.124小時尿蛋白定量：6周末，與NC相比，DM組大鼠24小時尿蛋白水平升高（p0.05）；與DM組相比，MTH組24小時尿蛋白下降（P 0.05），MTL組無明顯差異（p＞0.05）。給藥12周末，與NC相比，DM組大鼠24小時尿蛋白水平升高（P 0.05）；與DM組相比，各給藥組均能降低大鼠24小時尿蛋白水平（p 0.05）。 2.2血肌酐、尿素氮：6周末，與NC相比，DM組大鼠血肌酐、尿素水平升高（p 0.01）；與DM組相比，各給藥組血肌酐、尿素水平下降（p 0.05）。給藥12周末，，與NC相比，DM組大鼠血肌酐、尿素水平升高（p 0.01）；與DM組相比，各給藥組均能顯著降低大鼠血肌酐水平以及尿素水平（p0.01）。 3氧化應激指標 3.1MDA的比較：6周末，與NC組相比，DM組大鼠腎組織內的MDA水平顯著升高（p 0.05）；與DM組相比，各給藥組的MDA水平均有不同程度的下降。12周末，與NC組相比，DM組大鼠腎組織內的MDA水平明顯升高（p0.05）；與DM組相比，各給藥組均能顯著降低大鼠腎組織內的MDA水平（p 0.05）。 3.2T-AOC的比較：6周末，與NC組相比，DM組大鼠腎組織內的T-AOC活性顯著降低（p 0.05）；與DM組相比，各給藥組的T-AOC活性顯著增高（p 0.05）。12周末，與NC組相比，DM組大鼠腎組織內的T-AOC活性顯著降低（p 0.05）；與DM組相比，MTL組腎組織內的T-AOC活性升高（P 0.05），MTH組升高（p 0.05）。 4組織化學變化：光鏡顯示, NC組大鼠的腎臟組織結構清晰，未見明顯的病理改變。12周末時，與同期正常組的腎組織相比, DM組腎小球體積增大，腎小球系膜基質彌漫增多,系膜細胞增多，基底膜增厚。同期MT組腎臟的病理結構得到改善。 5免疫組織化學結果：糖尿病大鼠腎臟組織于6周、12周末，DM組與NC組比較腎組織中Nrf2的表達增多，MTL組高于DM組，MTH組高于MTL組（p＜0.05）；6周末DM組較NC組Trx表達升高，但低于同期MTL組、MTH組(p＜0.05)；12周末DM組Trx較NC組減少，MTL組高于DM組，MTH組高于DM組（p＜0.05）。 6Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)結果：DM組、MTH、MTL組與NC組比較大鼠腎組織中Nrf2的表達增多，其中12周末增多更為顯著（p＜0.05）；6周末DM組較NC組Trx表達升高，且低于同期MTL組、MTH組(p＜0.05)；12周末DM組Trx較NC組減少，MTL組高于DM組，MTH組高于DM組（p＜0.05）。 結論： 1糖尿病大鼠腎組織MDA含量增多，T-AOC活性下降，且糖尿病腎組織Nrf2、Trx表達較正常組明顯增多，顯示存在明顯的氧化應激狀態(tài)，Nrf2通路被激活。 2金屬硫蛋白可以減少糖尿病大鼠蛋白尿的產生及減輕腎臟病理形態(tài)學改變，且降低腎組織MDA含量，提高T-AOC的活性，其機制可能與上調Nrf2蛋白及其下游抗氧化蛋白Trx的表達有關，從而減輕氧化應激，起到保護腎臟的作用。
[Abstract]:Objective: This study intends to establish a rat model of type 1 diabetes mellitus, indicators of oxidative stress in renal tissues of rats in the determination of malondialdehyde (MDA) content and total antioxidant capacity (T-AOC) activity, immunohistochemistry, reverse transcription PCR of renal tissue detection methods such as Nrf2, Trx expression, and metallothionein (metallothionein MT) intervention, intervention effect on kidney of diabetic rats whether oxidative stress and metallothionein, which delay the occurrence and development of renal injury. For the prevention and treatment of diabetic kidney damage human provide experimental theory basis.
Diabetes and oxidative stress in the body, the lipid peroxidation increased, antioxidant capacity decreased the cell.Nrf2-ARE pathway is one of the most important antioxidant pathway. The nuclear factor EF-E2 related factor (Nrf2) by reactive oxygen species (ROS) stimulation by combining with ARE elements, activate the downstream protective gene transcription, including thioredoxin (Trx), quinone oxidoreductase (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1 Heine, oxygen ase1, etc.), improve the antioxidant capacity, reduce oxidative stress injury.
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本文編號：1661055