發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 01:37

  本文選題：TPX2　切入點(diǎn)：膀胱癌　出處：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：在世界范圍內(nèi)，膀胱癌在美國(guó)是第七位最常發(fā)生的腫瘤，每年大約有13,000人因此死亡，在中國(guó)居泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率的第一位。膀胱尿路上皮癌作為最常見的膀胱癌亞型占所有膀胱癌的90%以上。盡管膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展期間其診斷策略和生物分子標(biāo)記研究取得了很大的進(jìn)展，但是多于30%的膀胱尿路上皮癌病人復(fù)發(fā)，并最終進(jìn)展為浸潤(rùn)型。因而，尋找和鑒定新的診斷或治療膀胱癌病人的分子標(biāo)記具有十分重要的意義。 研究顯示，惡性腫瘤是一種以細(xì)胞增殖、分化以及凋亡異常為特征的疾病。其主要特點(diǎn)是細(xì)胞的無限增殖能力和細(xì)胞周期的異常調(diào)控，這些成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因。近年來，科研人員對(duì)腫瘤的關(guān)注逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周期的調(diào)控上，尤其是中心體，并發(fā)現(xiàn)中心體在調(diào)控細(xì)胞周期分布的變化以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)中發(fā)揮重要的作用。因此中心體相關(guān)蛋白是繼細(xì)胞周期，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡之后又一個(gè)腫瘤研究的熱點(diǎn)。此外，越來越多的研究顯示，中心體有望成為惡性腫瘤治療的新的分子靶點(diǎn)，從而為惡性腫瘤的分子靶向治療開辟了新的途徑。 TPX2是目前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與中心體密切相關(guān)的蛋白，在腫瘤細(xì)胞染色體20q經(jīng)常出現(xiàn)基因的擴(kuò)增，其中常常伴有TPX2的擴(kuò)增存在。此外，TPX2也是一個(gè)微管相關(guān)蛋白，主要是哺乳動(dòng)物細(xì)胞在著絲粒處負(fù)責(zé)微管的組裝和形成，這一過程是通過與非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白類似的蛋白2（Xenopus kinesin-like protein2，Xklp2）的羧基末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來介導(dǎo)的。TPX2是Ran-GFP的下游調(diào)控基因，在紡錘體的組裝和形成中發(fā)揮重要作用。在有絲分裂早期，TPX2以依賴RanGTP的方式被釋放，從而和AuroraA激酶相互作用，進(jìn)而起始紡錘體的裝配。TPX2的表達(dá)在細(xì)胞周期階段被嚴(yán)密的調(diào)控，經(jīng)常在G1向S期過渡的時(shí)期可見其表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)分裂時(shí)表達(dá)消失。因而TPX2表達(dá)對(duì)于評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖行為具有重要的價(jià)值。 近幾年來，許多腫瘤中呈現(xiàn)出TPX2的異常表達(dá)，如在非小細(xì)胞肺癌中染色體20q11.2的擴(kuò)增驅(qū)動(dòng)了TPX2的拷貝數(shù)顯著增加，胰腺導(dǎo)管腺癌中高水平的TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)以及多于50%的巨大細(xì)胞骨腫瘤病人中呈現(xiàn)TPX2的高表達(dá)，這些研究提示TPX2可能成為腫瘤診斷和治療的新的分子靶點(diǎn)。然而，迄今為止，世界范圍內(nèi)均未見TPX2在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用的研究報(bào)道，因此為了初步闡明TPX2在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，在本研究中，作者首先通過免疫組織化學(xué)，半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膀胱癌組織和正常組織中TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)，并通過半定量RT-PCR檢測(cè)不同臨床階段和不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)的膀胱癌組織中TPX2的表達(dá)，分析其表達(dá)與膀胱癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，并通過資料隨訪探討其表達(dá)與膀胱癌病人預(yù)后之間的關(guān)系，初步探討其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。進(jìn)一步通過TPX2基因獲得或缺失技術(shù)分別上調(diào)或下調(diào)膀胱癌細(xì)胞TPX2的表達(dá)，研究其表達(dá)變化對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。最后采用裸鼠移植瘤模型研究TPX2表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。該研究有望為以TPX2為靶點(diǎn)的膀胱癌的分子靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 第一部分TPX2在膀胱癌組織中的表達(dá)及其在膀胱癌病人預(yù)后中的價(jià)值 方法 （1）采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)71例膀胱癌組織和相應(yīng)的71例正常膀胱組織中TPX2蛋白表達(dá)。 （2）采用半定量RT-PCR分析了隨機(jī)選擇的21例膀胱癌組織和相對(duì)應(yīng)的正常組織中TPX2mRNA的表達(dá)。 （3）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)隨機(jī)選擇的8例膀胱癌組織和相對(duì)應(yīng)的正常組織中TPX2mRNA的表達(dá)。 （4）采用Kaplan Meier存活曲線分析TPX2蛋白表達(dá)與膀胱癌病人預(yù)后之間的關(guān)系。 （5）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用X±S表示。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用X2進(jìn)行評(píng)估，半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用單因素方差分析（One-wayANOVA），TPX2表達(dá)和膀胱癌病人預(yù)后之間的關(guān)系采用Kaplan Meier存活曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 （1）TPX2主要定位于膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。免疫組化的結(jié)果顯示，TPX2在膀胱癌中高表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá)。71例膀胱癌組織中TPX2的陽性表達(dá)率83.10%（59/71）高于正常組織12.68%（9/71），兩者比較差異具有顯著性（P0.05）。 （2）膀胱癌組織中TPX2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平為0.485±0.06，顯著高于正常組織中TPX2mRNA的表達(dá)水平（0.051±0.006），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，每例膀胱癌組織中TPX2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于對(duì)應(yīng)的正常膀胱組織中TPX2mRNA的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （4）TPX2蛋白表達(dá)與膀胱癌患者的性別和年齡無關(guān)（P0.05），但與患者的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P0.05）。最為顯著的是，，在19例具有轉(zhuǎn)移的膀胱癌病人中，TPX2蛋白表達(dá)的陽性率為100%。 （5）膀胱癌患者處于pT2-T4階段的組織標(biāo)本中TPX2mRNA的表達(dá)水平顯著高于pTa-T1階段的膀胱癌患者，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （6）具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者其TPX2mRNA的表達(dá)水平顯著高于無轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （7）具有TPX2高表達(dá)的膀胱癌患者的存活時(shí)間顯著低于TPX2低表達(dá)或無表達(dá)的膀胱癌患者，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 第二部分TPX2在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用 方法 （1）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)膀胱癌T24、J82、5637和RT4細(xì)胞中TPX2mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。 （2）利用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1空載體、pcDNA-TPX2真核表達(dá)載體、TPX2siRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，采用800μg/ml的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)TPX2和pcDNA3.1的膀胱癌T24穩(wěn)定細(xì)胞株。 （3）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting對(duì)轉(zhuǎn)染前后的膀胱癌T24細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。 （4）采用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPX2過表達(dá)或表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響。 （5）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPX2過表達(dá)或表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞周期和凋亡的影響。 （6）采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后T24細(xì)胞中cyclin D1、cdk2和p21蛋白表達(dá)的變化。 （7）采用caspase-3比色分析試劑盒分析轉(zhuǎn)染前后T24細(xì)胞中caspase-3活性的變化。 （8）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 （1）T24細(xì)胞中呈現(xiàn)最高TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)水平，顯著著高于J82，5637和RT4細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），此外，RT4呈現(xiàn)出最低的TPX2mRNA和蛋白的水平，與其它細(xì)胞株相比，TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)具有顯著性差異（P0.05）。 （2）pcDNA-TPX2轉(zhuǎn)染組中TPX2mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于未處理組和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組中TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)無差異（P0.05）。 （3）TPX2siRNA組中TPX2mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于未處理組和對(duì)照siRNA組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組中TPX2mRNA和蛋白的表達(dá)無差異（P0.05）。 （4）TPX2過表達(dá)的膀胱癌T24細(xì)胞的增殖速度明顯快于未處理組和空載體pcDNA3.1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1組相比，膀胱癌T24細(xì)胞的增殖速度無差異（P0.05）。此外，TPX2下調(diào)的膀胱癌T24細(xì)胞的增殖速度明顯慢于未處理組和對(duì)照siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組相比，膀胱癌T24細(xì)胞的增殖能力無差異（P0.05）。 （5）pcDNA-TPX2組中T24細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比率顯著低于未處理組和空載體pcDNA3.1組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1組中T24細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比率無差異（P0.05），而S期細(xì)胞數(shù)的比率在三組之間無差異（P0.05），而G2/M期的細(xì)胞數(shù)比率顯著高于未處理組和空載體pcDNA3.1組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。此外，TPX2siRNA組中T24細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率顯著高于未處理組和對(duì)照siRNA組，而S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)的比率顯著低于未處理組和對(duì)照siRNA組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相上細(xì)胞數(shù)的比率無差異（P0.05）。 （6）TPX2表達(dá)上調(diào)顯著上調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞中cyclin D1和cdk2蛋白的表達(dá)，而顯著下調(diào)p21蛋白的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1組中上述蛋白的表達(dá)無差異（P0.05）。進(jìn)一步研究顯示，TPX2表達(dá)下調(diào)顯著降低膀胱癌T24細(xì)胞中cyclin D1和cdk2蛋白的表達(dá)，而顯著增加p21蛋白的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組中上述蛋白的表達(dá)無差異（P0.05）。 （7）與未處理組和空載體pcDNA3.1組相比，pcDNA-TPX2組中膀胱癌T24細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1組中膀胱癌T24細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。此外，與未處理組和對(duì)照siRNA組相比，TPX2siRNA組中膀胱癌T24細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組中膀胱癌T24細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 （8）TPX2表達(dá)上調(diào)顯著降低膀胱癌T24細(xì)胞中caspase-3的活性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），而未處理組和空載體pcDNA3.1組中caspase-3的活性無差異（P0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TPX2表達(dá)下調(diào)顯著提升膀胱癌T24細(xì)胞中caspase-3的活性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），而未處理組和對(duì)照siRNA組中caspase-3的活性無差異（P0.05）。 第三部分TPX2表達(dá)變化在膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)中的作用 方法 （1）實(shí)驗(yàn)分組：TPX2過表達(dá)分組：未處理組：接種未經(jīng)任何處理的膀胱癌T24細(xì)胞；空載體轉(zhuǎn)染組：接種穩(wěn)定表達(dá)空載體pcDNA3.1的膀胱癌T24細(xì)胞；pcDNA-TPX2組：接種過表達(dá)TPX2的膀胱癌T24細(xì)胞。TPX2表達(dá)下調(diào)分組：未處理組：不進(jìn)行任何治療；對(duì)照siRNA組：腫瘤內(nèi)注射對(duì)照siRNA進(jìn)行治療；TPX2siRNA組：腫瘤內(nèi)注射TPX2siRNA進(jìn)行治療。 （2）對(duì)于TPX2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，接腫膀胱癌T24細(xì)胞后，當(dāng)瘤體達(dá)到80mm3左右時(shí)，每隔3天記錄腫瘤的體積，當(dāng)記錄全部結(jié)束后，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并剝離腫塊，稱量瘤體重量，比較不同組別的腫瘤重量。對(duì)于TPX2表達(dá)下調(diào)的實(shí)驗(yàn)，待腫瘤長(zhǎng)到55-80mm3時(shí)，每3天注射一次對(duì)照siRNA和TPX2siRNA（100ng/μl），并每隔3天記錄腫瘤的體積，當(dāng)記錄全部結(jié)束后，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并剝離腫塊，稱量瘤體重量，比較不同組別的腫瘤重量。 （3）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同組別的膀胱癌T24細(xì)胞的裸鼠移植瘤中TPX2mRNA的表達(dá)水平。 （4）采用Western blotting檢測(cè)不同組別的膀胱癌T24細(xì)胞的裸鼠移植瘤中TPX2蛋白的表達(dá)水平。 （5）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用x±s表示，多個(gè)樣本的均數(shù)采用單因素方差分析。P0.05，表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 （1）TPX2過表達(dá)的T24細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織中的TPX2mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于未處理組和空載體pcDNA3.1組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （2）TPX2siRNA治療后的膀胱癌裸鼠腫瘤組織中的TPX2mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于未處理組和對(duì)照siRNA組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （3）TPX2過表達(dá)組中裸鼠腫瘤的重量顯著高于未處理組和空載體pcDNA3.1組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （4）TPX2表達(dá)下調(diào)組中裸鼠腫瘤的重量顯著低于未處理組和對(duì)照siRNA組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （5）TPX2表達(dá)上調(diào)顯著加速裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，而TPX2表達(dá)下調(diào)顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)論 （1）TPX2的高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 （2）TPX2可能成為膀胱癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)記。 （3）TPX2的過表達(dá)加速膀胱癌T24細(xì)胞的增殖、縮短G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率和抑制細(xì)胞凋亡。而TPX2表達(dá)下調(diào)抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖、增加G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 （4）TPX2介導(dǎo)的細(xì)胞周期和凋亡變化與cyclin D1、cdk2、p21和caspase-3的表達(dá)或活性變化密切相關(guān)。 （5）TPX2過表達(dá)顯著促進(jìn)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并顯著增加其重量，而TPX2表達(dá)下調(diào)顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并且顯著降低其重量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Cancer Incidence and Mortality in China,2007[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年01期

本文編號(hào)：1660990