本文選題：尿道重建　切入點：血管內(nèi)皮細胞生長因子　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景尿道缺損是常見的泌尿系統(tǒng)疾病,以外科手術(shù)重建缺損尿道是其有效的治療手段,復(fù)雜性尿道缺損的重建是泌尿外科最具挑戰(zhàn)性的手術(shù)之一。獲取適宜的尿道重建替代材料是提高手術(shù)效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié),臨床上通常采用自體組織重建缺損尿道,面臨材料來源不足,術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高等問題,制備適宜的功能性生物材料有望解決這些自體組織無法克服的問題,成為尿道重建替代材料的可靠來源。尿道富含血管組織,豐富的血供對保持尿道正常形態(tài)和功能,促進損傷修復(fù)及組織再生都有著重要意義,VEGF作為特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原,在促進尿道組織再生中有著重要的應(yīng)用價值。在以VEGF作為生物活性因子制備功能性材料的研究中,如何有效的將因子與材料相結(jié)合,建立因子的靶向結(jié)合-釋放系統(tǒng),在重建局部形成持續(xù)有效的生長因子微環(huán)境,更好的促進組織再生是目前急需解決的問題。膠原結(jié)合域(CBD)能夠特異性的結(jié)合于膠原蛋白,利用基因工程的方法將CBD偶聯(lián)于VEGF,能夠介導(dǎo)VEGF與膠原蛋白特異性結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建以膠原材料為基質(zhì),以CBD-VEGF為生物活性因子的功能性支架材料,既可以發(fā)揮材料的三維支持作用,又能夠為組織再生提供持續(xù)有效的生物活性信號,以這種功能性生物材料重建尿道缺損將有利于尿道重建術(shù)后的尿道組織再生與功能恢復(fù)。材料與方法1.NAT-VEGF及CBD-VEGF重組蛋白的表達、純化及鑒定。以載體pET28a及大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建NAT-VEGF和CBD-VEGF原核表達系統(tǒng)。重組質(zhì)粒pET28a-VEGF及pET28a-CBD-VEGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌,以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,Ni純化柱純化重組蛋白,SDS-PAGE電泳對重組蛋白NAT-VEGF及CBD-VEGF進行鑒定。2.NAT-VEGF及CBD-VEGF重組蛋白與膠原蛋白的結(jié)合能力檢測。以ELISA法檢測NAT-VEGF、CBD-VEGF重組蛋白與膠原蛋白的結(jié)合能力,不同濃度的重組蛋白(0、0.094μM、0.1875μM、0.375μM、0.75μM、1.5μM、3μM、6μM),加入鋪有等體積Ⅰ型膠原蛋白的酶標(biāo)板,結(jié)合2小時后以pbs洗去未結(jié)合的重組蛋白,依次加入anti-vegfantibody、anti-rabbitigg,顯色后以酶標(biāo)儀測定405nm處吸光值,用以比較兩種重組蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)合力。3.nat-vegf及cbd-vegf重組蛋白在膠原蛋白材料上釋放特征檢測將等量的nat-vegf或cbd-vegf滴加于鋪有等體積Ⅰ型膠原蛋白的酶標(biāo)板,結(jié)合2小時后每孔加入500μlpbs,此后每隔12小時每孔吸除400μlpbs,更換為400μl新鮮的pbs。結(jié)合完成時以及此后每24小時以酶標(biāo)儀測定405nm處吸光值,評價膠原蛋白膜上留存的重組蛋白含量,以結(jié)合完成時為100%,計算每個時間節(jié)點上膠原蛋白膜上留存的因子量的百分比,用以評價nat-vegf及cbd-vegf重組蛋白在膠原材料上的釋放特征。4.nat-vegf及cbd-vegf重組蛋白的生物活性檢測。以商業(yè)化的vegf(rhvegf)為對照,評價非膠原結(jié)合狀態(tài)及膠原結(jié)合狀態(tài)下nat-vegf、cbd-vegf促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的活性。人臍靜脈內(nèi)皮細胞常規(guī)培養(yǎng)8小時后分別加入干預(yù)因素nat-vegf、cbd-vegf及rhvegf,終濃度為0、0.094μm、0.1875μm、0.375μm、0.75μm、1.5μm、3μm、6μm,每組6孔,并繼續(xù)培養(yǎng)3天,以mmt法測定細胞增殖情況,用于評價nat-vegf、cbd-vegf重組蛋白的生物活性。5.cbd-vegf修飾的膠原支架材料在比格犬尿道缺損重建中的作用。將15只成年雄性比格犬隨機分為三組:collagen組、collagen-cbd-vegf組、mscs組,每組5只。于陰莖骨與球部尿道之間完整切除5cm長的尿道海綿體,建立犬尿道缺損模型。分別以單純膠原支架材料、cbd-vegf修飾的膠原支架材料,負(fù)載mscs的膠原支架材料重建尿道缺損。通過比格犬術(shù)后排尿情況、尿動力學(xué)檢查、尿道造影等評價重建尿道功能及形態(tài)。術(shù)后半年,收集重建尿道標(biāo)本,以he染色、masson染色、免疫熒光檢測評價重建尿道的組織再生、基質(zhì)代謝等情況。主要結(jié)果1.利用基因工程技術(shù)成功的表達nat-vegf及cbd-vegf重組蛋白。nat-vegf及cbd-vegf重組蛋白單體大小分別為18kda、20kda。2.ni純化柱能夠完成對重組蛋白的純化,純化后的cbd-vegf重組蛋白能夠特異性結(jié)合于膠原蛋白,并在膠原蛋白材料上平穩(wěn)釋放。3.非膠原結(jié)合狀態(tài)下cbd-vegf具有與nat-vegf、rhvegf相似的生物活性,在膠原結(jié)合狀態(tài)下cbd-vegf的生物活性顯著高于nat-vegf及rhvegf,能夠更好的促進臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖。4.CBD-VEGF與MSCs均能夠顯著促進尿道上皮組織再生,促使重建尿道形成近似于正常尿道的上皮層。CBD-VEGF與MSCs均能夠促進平滑肌組織再生,但重建尿道內(nèi)的平滑肌組織無法達到正常尿道水平,且再生的平滑肌走行雜亂、無規(guī)律。CBD-VEGF能夠更好的促進血管組織再生,促使部分新生血管形成形態(tài)類似于正常尿道海綿體的血竇樣結(jié)構(gòu)。此外,CBD-VEGF能夠減少細胞外基質(zhì)中膠原蛋白沉積,有利于減輕重建尿道的攣縮。5.CBD-VEGF和MSCs均能改善比格犬尿道重建術(shù)后排尿狀態(tài),尿道造影顯示二者尿道直徑無顯著差異,CBD-VEGF組的重建尿道的平均尿道壓力低于MSCs組。結(jié)論利用載體pET28a及大腸桿菌BL21(DE3),能夠成功表達NAT-VEGF、CBD-VEGF重組蛋白。非膠原結(jié)合狀態(tài)下CBD-VEGF與NAT-VEGF、rhVEGF具有相似的生物活性,膠原結(jié)合狀態(tài)下CBD-VEGF的生物活性高于NAT-VEGF、rhVEGF。相較于NAT-VEGF,CBD-VEGF能夠特異性結(jié)合于膠原蛋白,平穩(wěn)釋放,可以建立VEGF特異性的靶向結(jié)合-釋放系統(tǒng)。在比格犬長段尿道缺損重建模型中CBD-VEGF能夠促進尿道組織再生,改善重建尿道功能,其效果達到并部分超過MSCs。Collagen-CBD-VEGF可以成為制備功能性尿道支架的候選材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R699;R318.08

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李祖兵,A．NormanCranin,MarkC．Mehrali;生物可吸收引導(dǎo)組織再生膜的實驗研究[J];口腔醫(yī)學(xué)縱橫;1998年04期

2 于慧君;培養(yǎng)新的生命──干細胞開創(chuàng)了人體組織再生的醫(yī)學(xué)范例[J];世界科學(xué);1998年08期

3 楊衛(wèi)星;引導(dǎo)組織再生術(shù)在牙周及根周病治療中的應(yīng)用[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2002年01期

4 潘韶霞;馮海蘭;;礦化膠原復(fù)合物引導(dǎo)組織再生膜體外性能測試[J];口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志;2005年04期

5 張浩;引導(dǎo)性組織再生膜材料的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊;1997年01期

6 陳曉東;用擠出工藝制造用于引導(dǎo)組織再生的多孔可降解聚合物導(dǎo)管[J];國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊;1999年03期

7 楊瑟飛,施生根,崔燕;引導(dǎo)組織再生術(shù)在牙科種植領(lǐng)域的應(yīng)用[J];中國口腔種植學(xué)雜志;1998年04期

8 商英楠;;引導(dǎo)組織再生術(shù)后患牙正畸治療效果觀察[J];中國實用口腔科雜志;2014年03期

9 ;特拉華大學(xué)的科學(xué)家研制出一種新的能使人類組織再生的低黏性凝膠[J];現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用;2007年05期

10 葛柳瑩;趙利芬;段開文;;牙周引導(dǎo)組織的再生膜材料[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年42期

相關(guān)會議論文 前7條

1 李全利;寧天云;曹穎;劉巍;祝小鵬;劉來奎;;仿生礦化誘導(dǎo)牙體組織再生[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會口腔材料學(xué)專業(yè)委員會第七次全國口腔材料學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2011年

2 任天斌;曹春紅;吳國良;袁偉忠;宋瑩;任杰;;靜電紡絲法制備梯度引導(dǎo)組織再生膜[A];2009年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2009年

3 秦泗河;郭保逢;焦紹鋒;;牽拉組織再生與微循環(huán)重建術(shù)[A];第三屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨科微創(chuàng)學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2013年

4 石銳;朱愛臣;陳大福;袁潤英;張立群;;引導(dǎo)組織再生用多孔PVA/淀粉薄膜的制備及其結(jié)構(gòu)與性能研究[A];2009年全國高分子學(xué)術(shù)論文報告會論文摘要集（下冊）[C];2009年

5 李學(xué)敏;劉玲蓉;陳漢;張其清;;雙層復(fù)合膠原基引導(dǎo)組織再生材料制備和表征[A];2006年全國功能材料學(xué)術(shù)年會專輯[C];2006年

6 孫皎;何偉;孟愛英;;PGLA牙周引導(dǎo)組織再生片體外生物降解性和安全性評價研究[A];第九屆全國生物材料學(xué)術(shù)會議（CBMS-9）論文集[C];2002年

7 莫秀梅;陳宗剛;李曉強;何創(chuàng)龍;王紅聲;王勝;;靜電紡納米纖維仿生組織細胞外基質(zhì)用于組織再生[A];2009年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 醫(yī)學(xué)院;醫(yī)學(xué)院生醫(yī)系開發(fā)出可注射組織再生新技術(shù)[N];新清華;2014年

2 李曉疆;創(chuàng)新科技喚醒組織再生[N];科技日報;2013年

3 曉疆;沖破組織再生禁區(qū)[N];科技日報;2013年

4 本報記者 沈英甲;機體組織再生能否讓生命延續(xù)？(上)[N];科技日報;2007年

5 欒海;俄專家發(fā)現(xiàn)促使蠑螈眼組織再生的基因[N];大眾科技報;2002年

6 劉伯寧;干細胞研究：追逐組織再生和器官修復(fù)的夢想[N];中國醫(yī)藥報;2010年

7 沈英甲;人工臟器·臟器移植·機體組織再生[N];中國中醫(yī)藥報;2001年

8 本報記者 沈英甲;機體組織再生能否讓生命延續(xù)？(下)[N];科技日報;2007年

9 陳超;日科學(xué)家成功再生肝組織細胞[N];科技日報;2005年

10 李曉疆;揭開改變再生環(huán)境的奧秘[N];科技日報;2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 賈維勝;功能性生物支架材料誘導(dǎo)尿道組織再生的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 何敏;同軸紡絲制備載藥型引導(dǎo)組織再生膜[D];北京化工大學(xué);2015年

2 李秀華;殼聚糖基引導(dǎo)組織再生膜對大鼠顱骨缺損的修復(fù)作用[D];中國海洋大學(xué);2015年

3 朱國強;牙周引導(dǎo)組織再生治療Ⅱ～Ⅲ度根分叉區(qū)病變的臨床研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 張映娟;無髓年輕恒牙組織再生術(shù)的實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

5 駱凱;引導(dǎo)組織再生膠原膜作為牙周組織工程支架材料可行性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2003年

，

本文編號：1630259