本文選題：急性腎損傷　切入點：缺血再灌注　出處：《上海交通大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分缺血再灌注急性腎損傷中自噬的動態(tài)改變及與腎損傷的關(guān)系目的:體內(nèi)外觀察自噬與凋亡在缺血再灌注急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)中的動態(tài)改變,探討AKI過程中自噬與凋亡的關(guān)系。方法:80只雄性BALB/c小鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham,n=40)和腎臟缺血再灌注組(ischemia/reperfusion組,I/R,n=40),采用雙側(cè)腎蒂夾閉法建立缺血再灌注模型,于再灌注后0h、2h、5h、12h、1d、2d、3d和7d收集小鼠的血液及腎組織;體外培養(yǎng)腎小管細胞(TCMK-1)隨機分為常氧組(Normoxic,Nor組)、低氧組(Hypoxia,H6h,H12h,H24h組)和低氧/復氧組(Hypoxia/Reoxygenation,H/R2h,H/R4h,H/R8h,H/R24h組),檢測小鼠腎功能;HE染色觀察腎組織損傷情況;Annexin-V/PI染色檢測細胞凋亡率;CCK-8方法檢測細胞活性;Western blotting檢測腎組織和細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達情況,電鏡觀察腎組織和細胞的自噬體結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1、體內(nèi)實驗:與Sham組相比,I/R 2h腎組織自噬表達開始升高(p0.05),表現(xiàn)為LC3-II/LC3-I的比值增高及p62蛋白表達的下降;第2d自噬水平最高(p0.001),至第3d自噬開始下降但仍高于Sham組(p0.05),第7d自噬降至正常水平,電鏡下缺血再灌注第1d腎組織內(nèi)出現(xiàn)吞噬了損傷線粒體和胞漿成分的自噬體結(jié)構(gòu);相比而言I/R后腎組織凋亡出現(xiàn)較晚,在I/R 12h時腎組織Bcl-2/Bax比值開始下降,明顯低于Sham組(p0.01),第1d時凋亡最明顯(p0.001),隨再灌注時間的延長腎組織凋亡逐漸減輕,至第3d Bcl-2/Bax比值已恢復至正常;血Scr和BUN分別在再灌注2h和5h開始上升,至第1d達峰值(Scr:130.00±30.07umol/L vs 14.00±6.60 umol/L,BUN:45.57±8.67 mmol/L vs8.18±2.17 mmol/L;p值均0.001),隨后開始降低,分別在術(shù)后第7d和第2d恢復正常;HE染色顯示再灌注第1d近端小管上皮細胞出現(xiàn)了相應(yīng)的組織學損傷表現(xiàn),至第7d腎組織損傷明顯減輕;2、體外實驗?zāi)I小管細胞低氧刺激12h后腎小管細胞自噬開始上調(diào)(p0.05),延長低氧至24h自噬進一步升高(p0.001),細胞復氧4h、8h自噬水平開始下降但仍高于常氧組(p0.05),電鏡下復氧4h腎小管細胞內(nèi)大量自噬體吞噬胞漿成分,復氧24h自噬降至正常水平;而細胞低氧刺激24h凋亡才開始出現(xiàn),且復氧4h、8h后Bcl-2/Bax比值較單純低氧24h組下降更明顯(p0.05),至復氧24h仍未恢復正常(p0.001);流式細胞術(shù)和CCK-8檢測也發(fā)現(xiàn)低氧刺激24h后細胞凋亡開始增多,細胞活性開始下降(p0.05),復氧4h、8h凋亡細胞進一步增加,細胞活性也進一步下降,直至復氧24h細胞凋亡、活性仍未恢復正常。結(jié)論:缺血再灌注AKI損傷早期,自噬升高早于凋亡,而在AKI恢復期,自噬的下降晚于凋亡,自噬可能作為一種損傷適應(yīng)性反應(yīng)在AKI早期延緩凋亡的發(fā)生,在AKI恢復期促進腎組織的修復。第二部分調(diào)節(jié)自噬表達在缺血再灌注急性腎損傷中的作用及作用機制目的:觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或自噬激動劑雷帕霉素(Rapamycin,Rap)預處理對缺血再灌注時腎損傷的影響,探討自噬在AKI中發(fā)揮的作用。方法:1.體內(nèi)實驗:40只雄性BALB/c小鼠隨機分為假手術(shù)+veh組(SD1+veh,n=5)、假手術(shù)+3-MA組(SD1+3-MA,n=5)、缺血再灌注24h+veh組(ID1+veh,n=5)、缺血再灌注24h+3-MA組(ID1+3-MA,n=5);假手術(shù)+veh組(SD1+veh,n=5)、假手術(shù)+Rapamycin組(SD1+Rap,n=5)、缺血再灌注24h+veh組(ID1+veh,n=5)、缺血再灌注24h+Rapamycin組(ID1+Rap,n=5);小鼠腎缺血前2h腹腔注射3-MA或Rapamycin,于再灌注24h收集血液及腎組織,檢測血Scr及BUN濃度的改變,HE染色觀察小管壞死情況,Western blotting檢測腎組織LC3、p62、Bcl-2、Bax、p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的表達情況,TUNEL方法檢測腎組織細胞凋亡;2.體外實驗:腎小管細胞隨機分為常氧+veh組(Nor+veh)、常氧+3-MA組(Nor+3-MA)、低氧/復氧+veh組(H/R+veh)、低氧/復氧+3-MA組(H/R+3-MA);常氧+veh組(Nor+veh)、常氧+Rapamycin組(Nor+Rap)、低氧/復氧+veh組(H/R+veh)、低氧/復氧+Rapamycin組(H/R+Rap);分別在細胞刺激前1h或4h加入3-MA或雷帕霉素,Western blotting檢測細胞LC3、p62、Bcl-2、Bax、p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的表達情況,TUNEL方法檢測腎小管細胞凋亡。結(jié)果:1.體內(nèi)實驗:補充3-MA可明顯抑制小鼠I/R 24h腎組織自噬水平,使其LC3-1向LC3-II轉(zhuǎn)換減少,p62蛋白降解減少;3-MA促進了小鼠I/R后凋亡的增加,腎組織Bcl-2/Bax比值較ID1+veh組顯著下降(p0.05);TUNEL結(jié)果也顯示ID1+3-MA組較ID1+veh組的凋亡細胞數(shù)明顯增多(62.67±10.97 vs 38.34±7.37,p0.05);補充3-MA使小鼠I/R損傷后的血BUN和Scr水平分別升高到ID1+veh組的1.47和1.49倍(BUN:66.78±11.13 mmol/L vs 45.57±10.39 mmol/L,p0.05;Scr:186.26±33.75 umol/L vs 125.21±27.82 umol/L,p0.05);HE染色也顯示補充3-MA后腎組織損傷明顯較ID1+veh組加重。相反,補充雷帕霉素可進一步上調(diào)腎組織I/R 24h誘導的自噬表達,表現(xiàn)為與ID1+veh組相比,ID1+Rap組腎組織LC3-II/LC3-I比值明顯增高,p62蛋白表達明顯下降(p0.05);雷帕霉素可促進I/R后腎組織Bcl-2/Bax比值上升,TUNEL結(jié)果也顯示ID1+Rap組凋亡細胞數(shù)較ID1+veh組明顯減少(19.43±4.16 vs 38.34±7.37,p0.05);另外補充雷帕霉素可顯著降低小鼠I/R后血Scr和BUN濃度(Scr:75.36±24.21 umol/L vs125.21±27.83 umol/L,BUN:27.3±7.99 mmol/Lvs45.58±10.39 mmol/L,p值均0.05);HE染色顯示與ID1+veh組相比,ID1+Rap組腎小管細胞的壞死、變性、管型的形成以及腎間質(zhì)炎性細胞的浸潤均明顯減輕;Western blotting檢測顯示,小鼠遭受I/R損傷后p-m TOR及其下游底物p-P70S6K和p-4E-BP1蛋白表達明顯低于SD1+veh組(p0.001),補充雷帕霉素后m TOR通路被抑制,使得腎組織I/R后的p-m TOR、p-P70S6K和p-4E-BP1蛋白表達較ID1+veh組進一步下降。2.體外實驗:Western blotting結(jié)果顯示:3-MA抑制腎小管細胞H/R誘導的自噬表達,并且明顯降低了細胞復氧后Bcl-2/Bax的比值,加重細胞凋亡損傷,共聚焦顯微鏡也觀察到3-MA使細胞復氧損傷后的TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增加;而補充雷帕霉素則更進一步激活了腎小管細胞低氧/復氧誘導的自噬水平,使腎小管細胞的凋亡也明顯減輕,凋亡形態(tài)學也觀察到H/R+Rap組TUNEL陽性細胞數(shù)顯著減少;m TOR信號通路檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),腎小管細胞H/R損傷后m TOR活性未被抑制,p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1的蛋白表達水平與Nor+veh組相比無統(tǒng)計學差異,而補充雷帕霉素顯著抑制了低氧/復氧刺激后腎小管細胞的m TOR活化,使細胞p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的磷酸化水平顯著低于H/R組。結(jié)論:缺血再灌注AKI誘導的自噬可能發(fā)揮腎保護作用,雷帕霉素可以上調(diào)腎I/R損傷后自噬的表達,可能與雷帕霉素抑制m TOR及其下游底物P70S6K、4E-BP1的磷酸化水平有關(guān)。第三部分Klotho蛋白對缺血再灌注急性腎損傷中自噬的作用目的:體內(nèi)外觀察補充外源性Klotho蛋白對缺血再灌注AKI中自噬的作用,探討Klotho蛋白對AKI的保護機制。方法:1、體內(nèi)實驗:25只雄性BALB/c小鼠隨機分為假手術(shù)+veh組(SD1+veh)、缺血再灌注+veh組(ID1+veh)、ID1+補充外源性可溶性Klotho蛋白組(ID1+kl)、缺血再灌注+3-MA組(ID1+3-MA)、ID1+3-MA+補充外源性可溶性Klotho蛋白組(ID1+3-MA+kl),每組5只,3-MA在術(shù)前2h經(jīng)腹腔注射,Klotho蛋白分別在術(shù)后30min和2h各腹腔注射一次,于再灌注24h收集血液和腎組織進行后續(xù)檢測。Western blotting檢測腎組織LC3和p62蛋白的表達情況,電鏡觀察腎組織自噬體數(shù)量改變;檢測血Scr及BUN濃度的改變,HE染色觀察小管壞死情況并做病理評分;TUNEL方法檢測腎組織細胞凋亡;2、體外實驗:腎小管細胞隨機分為Nor組、Nor+kl組、H/R組、H/R+kl組,外源性可溶性Klotho蛋白分別在低氧前4h和復氧時加入,于低氧/復氧4h收集細胞進行檢測。Western blotting檢測腎小管細胞LC3、p62、Bcl-2和Bax蛋白的表達情況,電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體數(shù)量改變;流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率。結(jié)果:1、體內(nèi)實驗:Western blotting結(jié)果顯示,補充Klotho蛋白明顯升高I/R 24h腎組織LC3-II/LC3-I的比值、降低p62蛋白表達,透射電鏡的結(jié)果也顯示給予Klotho蛋白可以明顯增加腎組織內(nèi)自噬體的數(shù)量,補充了3-MA使Klotho蛋白上調(diào)自噬的作用明顯減弱。補充Klotho蛋白可以明顯降低I/R 24h的血BUN和Scr的水平,HE染色和腎小管壞死評分也表明腎小管上皮細胞的變性、壞死、管型形成均減輕,腎組織TUNEL陽性凋亡細胞數(shù)顯著減少,補充3-MA降低了Klotho蛋白的抗凋亡作用。2、體外實驗:Western blotting和電鏡結(jié)果均顯示腎小管細胞在給予Klotho蛋白后,自噬水平及自噬體數(shù)量均較H/R組明顯上升,細胞Bcl-2/Bax比值也顯著升高,同樣流式細胞術(shù)檢測到給予Klotho蛋白可以明顯降低腎小管細胞復氧4h的早期凋亡率。結(jié)論:Klotho蛋白可能可以通過上調(diào)I/R腎組織自噬水平發(fā)揮抗凋亡作用,減輕AKI腎組織損傷。第四部分Klotho蛋白對低氧/復氧損傷后腎小管上皮細胞自噬的作用機制研究目的:體外觀察補充外源性Klotho蛋白或過表達Klotho蛋白在腎小管細胞低氧/復氧后對IGF-1/Akt/FOXO1通路的調(diào)節(jié),旨在探討Klotho蛋白在AKI中對自噬的作用機制。方法:TCMK-1隨機分為常氧組(Nor)、常氧+Klotho蛋白組(Nor+Kl)、低氧/復氧組(H/R)、低氧/復氧+Klotho蛋白組(H/R+Kl);IGF-1干預及過表達Klotho蛋白實驗分組:常氧+空載腺病毒感染組(Nor+Lac Z)、低氧/復氧組+空載腺病毒感染組(H/R+Lac Z)、低氧/復氧組+過表達Klotho腺病毒感染組(H/R+Ad-Kl)、低氧/復氧組+空載腺病毒感染+IGF-1組(H/R+Lac Z+IGF-1)、低氧/復氧組+過表達Klotho腺病毒感染+IGF-1組(H/R+Ad-Kl+IGF-1);Western blotting檢測細胞IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化改變及LC3和p62蛋白表達水平;流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率;共聚焦觀察FOXO1蛋白的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果:腎小管細胞H/R后IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化水平增高,補充外源性Klotho蛋白可明顯抑制腎小管細胞H/R后p-IGF-1R、p-Akt、p-FOXO1的蛋白表達,并且促進FOXO1蛋白向胞核轉(zhuǎn)位;補充IGF-1可明顯激活細胞H/R后的IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化水平,而過表達Klotho蛋白可以降低IGF-1對該通路的上調(diào);補充IGF-1促使腎小管細胞H/R損傷后細胞凋亡率增高,而過表達Klotho蛋白可以顯著降低腎小管細胞H/R后的早期凋亡,并且能夠減輕IGF-1所加重的細胞凋亡。結(jié)論:Klotho蛋白可能通過抑制腎小管細胞低氧/復氧后IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化及促進FOXO1蛋白的核轉(zhuǎn)位上調(diào)細胞自噬水平。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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本文編號：1609422