本文選題：足細(xì)胞　切入點(diǎn)：TGF-β1　出處：《右江民族醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分TRPC6在TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的表達(dá)及其高表達(dá)對(duì)Nephrin、Desmin表達(dá)的影響目的:體外研究瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6,TRPC6)在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化及其高表達(dá)對(duì)足細(xì)胞nephrin、desmin表達(dá)的影響。方法:以不同濃度(0ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、12ng/ml)TGF-β1刺激足細(xì)胞,干預(yù)72小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率,用免疫熒光、Real-time PCR、Wstern-blot檢測(cè)TRPC6的分布及m RNA和蛋白表達(dá)。再將未干預(yù)過(guò)的MPC5細(xì)胞分組,應(yīng)用12ng/ml TGF-β1處理各組細(xì)胞,分別于0、24、48、72小時(shí)應(yīng)用免疫熒光、Real-time PCR、Wstern-blot檢測(cè)TRPC6的分布及m RNA和蛋白表達(dá)。用脂質(zhì)體法將小鼠TRPC6真核表達(dá)載體p EX-3-TRPC6及對(duì)照質(zhì)�？蛰d體p EX-3-NC轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,48小時(shí)后應(yīng)用Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TRPC6蛋白水平評(píng)估轉(zhuǎn)染效率;同時(shí)應(yīng)用免疫熒光、real time RT-PCR及Western印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后nephrin、desmin分布及表達(dá)的變化。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,倒置顯微鏡下TGF-β1干預(yù)后足細(xì)胞足突融合、回縮,當(dāng)TGF-β1增加至12ng/ml時(shí)足突甚至消失。TGF-β1對(duì)足細(xì)胞增殖具有抑制作用,當(dāng)TGF-β1濃度增加至12ng/ml時(shí),作用72h對(duì)足細(xì)胞增殖抑制率接近50%。TGF-β1作用能使足細(xì)胞TRPC6表達(dá)及分布發(fā)生變化,當(dāng)TGF-β1濃度為4ng/ml,干預(yù)72小時(shí)后TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,當(dāng)TGF-β1濃度提高到為8、12ng/ml時(shí)TRPC6 m RNA和蛋白含量明顯升高(P0.05),并呈劑量依賴性。應(yīng)用12ng/ml干預(yù)24小時(shí),TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,當(dāng)干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)至48h、72h時(shí)TRPC6 m RNA和蛋白含量明顯升高(P0.05),并呈時(shí)間依賴性。p EX-3-TRPC6轉(zhuǎn)染48小時(shí)后足細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)水平明顯增高(P0.05),nephrin分布未發(fā)生變化,但表達(dá)量在m RNA及蛋白水平分別下降38%及48%左右(p0.05),desmin分布發(fā)生改變,表達(dá)量在m RNA及蛋白水平分別升高132%及116%左右(P0.05)。結(jié)論:TGF-β1可誘導(dǎo)足細(xì)胞TRPC6表達(dá)上調(diào)且分布變化,TRPC6高表達(dá)可影響nephrin、desmin表達(dá)及desmin的分布,這可能是TRPC6參與足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。第二部分TRPC6在TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的分子機(jī)制目的:探討基因敲低TRPC6對(duì)TGF-β1干預(yù)下足細(xì)胞nephrin、desmin、caspase9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。方法:體外培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞,用脂質(zhì)體法將針對(duì)TRPC6 shRNA干擾序列載體PGPU6/GFP/Neo-TRPC6-mus-581及對(duì)照質(zhì)粒空載體PGPU6/GFP/Neo-NC轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24及48小時(shí)后用用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),同時(shí)48小時(shí)后用western-blot檢測(cè)TRPC6蛋白表達(dá)水平評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組,TGF-β1干預(yù)組,TGF-β1+PGPU6/GFP/Neo-TRPC6-mus-581組(TRPC6低表達(dá)組),TGF-β1+PGPU6/GFP/Neo-NC組(空載體組),干預(yù)48小時(shí)后用western blot和real time PCR檢測(cè)caspase9、desmin、nephrin蛋白和m RNA表達(dá)水平,DAPI染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:轉(zhuǎn)染48h時(shí)足細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白較24h時(shí)明顯增強(qiáng),與正常對(duì)照組相比TRPC6低表達(dá)組TRPC6蛋白水平較正常對(duì)照組明顯下降(P0.05),空載體組TRPC6蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。與空白對(duì)照組相比,TGF-β1干預(yù)48小時(shí)后caspase9、desmin蛋白和m RNA表達(dá)水平顯著升高(P0.01),nephrin蛋白和m RNA表達(dá)水平明顯下降(P0.05),敲低TRPC6表達(dá)上述變化不明顯。DAPI結(jié)果顯示,TGF-β1干預(yù)后足細(xì)胞凋亡增多并出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。流失細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,TGF-β1干預(yù)組足細(xì)胞凋亡率為14%+2.1%,TRPC6低表達(dá)組凋亡率為10.9%+0.56%(P0.05),空載體組細(xì)胞凋亡率較TGF-β1干預(yù)組無(wú)明顯差異。結(jié)論:TGF-β1能誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,減少nephrin表達(dá),增加caspase9、desmin表達(dá),其機(jī)制可能與上調(diào)TRPC6表達(dá)密切相關(guān),敲低TRPC6表達(dá)能逆轉(zhuǎn)上述變化,對(duì)足細(xì)胞具有保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：右江民族醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1577594