本文選題：C末端調(diào)節(jié)蛋白　切入點(diǎn)：PI3K/Akt　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命。它的病理特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,腎小管上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化,并最終導(dǎo)致腎功能的進(jìn)行性衰竭。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)最主要的組成成分,大約有28種不同膠原類型被發(fā)現(xiàn),其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原是較為常見的。另外,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)及α平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)在多種器官和組織中均是公認(rèn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子。PI3K/Akt是一種多功能信號通路,具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、遷移、脂質(zhì)代謝及纖維化等的活性。PI3Ks通過磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)肌醇環(huán)的第3位碳原子,而形成PIP3,進(jìn)而激活A(yù)kt(又稱蛋白激酶B,protein kinase B,PKB)而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。新近研究揭示PI3K/Akt信號通路與糖尿病腎病纖維化的發(fā)生相關(guān)。我們前期的研究也揭示PI3K/Akt信號通路能夠上調(diào)TGF-β1及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)的表達(dá),介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞脂滴合成和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。因此,針對PI3K/Akt通路進(jìn)行調(diào)控干預(yù),成為防治糖尿病腎小球和腎小管病變的研究熱點(diǎn)。研究揭示PI3K/Akt通路的負(fù)向調(diào)控因子有SH2結(jié)構(gòu)含磷酸肌醇(SH2domain-containing inositol 5’-phosphatase,SHIP)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)和C末端調(diào)節(jié)蛋白(carboxyl-terminal modulator protein,CTMP)等。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)PTEN通過抑制Akt的活性能下調(diào)SREBP-1/FASN/ACC信號途徑及人腎小管上皮細(xì)胞的脂肪酸合成,同時還能抑制糖尿病小鼠腎臟結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。然而CTMP在糖尿病腎病細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響卻未見報道。因此,本研究應(yīng)用糖尿病小鼠模型以及體外高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞為研究對象,從動物及細(xì)胞水平上整體觀察糖尿病腎臟中CTMP蛋白表達(dá)情況,以及過表達(dá)的CTMP對磷酸化Akt(phospho-Akt(Ser 473))、TGF-β1、α-SMA等蛋白的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響。方法:1 phospho-Akt(Ser 473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ及FN在糖尿病小鼠腎臟的表達(dá)和意義將CD1小鼠隨機(jī)分為兩組:分別為正常對照組(normal control group,N組)以及糖尿病組(diabetes mellitus group,DM組),每組各10只。糖尿病小鼠模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中,p H值為4.5,150 mg/kg),對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液,48 h后尾尖取血測量血糖,血糖≥16.7 mmol/L者確定造模成功,未達(dá)標(biāo)者舍棄。于造模成功8周后處死小鼠,于處死前1天將各組小鼠在代謝籠中單獨(dú)飼養(yǎng)收集24 h尿液,用于記錄尿量,測量24 h尿蛋白水平。禁食6-8 h,將小鼠稱重后異氟烷吸入麻醉,隨后摘眼球取血,并迅速離心分離血清,用于血肌酐、血糖和血尿素氮的測定;取部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱,用于提取蛋白及RNA;另外部分腎組織置于4%多聚甲醛固定,用于石蠟包埋及制片。應(yīng)用Western blot、免疫組化以及Real-time PCR觀察糖尿病小鼠腎臟phospho-Akt、CTMP、TGF-β1、α-SMA、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ,ColⅢ)、纖維粘連蛋白(Fibronectin,FN)蛋白及CTMP m RNA的表達(dá)。2高糖對人腎小管上皮細(xì)胞phospho-Akt(Ser 473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表達(dá)和ColⅠ、ColⅢ分泌的影響人腎小管上皮細(xì)胞(HKC細(xì)胞)用含100 k U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并隨機(jī)分為正常糖對照組(5.5 mmol/L glucose,Control)以及高糖組(30 mmol/L glucose,HG),并于高糖刺激后0、6、12、24以及48 h收集細(xì)胞,提取總蛋白,Western blot檢測phospho-Akt(Ser 473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白的表達(dá);免疫細(xì)胞熒光檢測CTMP蛋白表達(dá)和定位;細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原(CollagenⅠ,ColⅠ)、ColⅢ分泌情況采用ELISA方法檢測。3 CTMP表達(dá)質(zhì)粒對高糖刺激人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表達(dá)和ColⅠ、ColⅢ分泌的影響人腎小管上皮細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(其中含有10%胎牛血清及100 k U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素),培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2。應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pYr-ads-4-CTMP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HKC,經(jīng)G418篩選,建立HKC CTMP基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常糖對照組(5.5 mmol/L glucose,Control),高糖組(30mmol/L glucose,HG),高糖及pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒對照組(HG+V),高糖及pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(HG+CTMP)。后三組給予高糖刺激48 h后終止培養(yǎng),進(jìn)行免疫熒光染色和蛋白提取。采用Western blot檢測phospho-Akt(Ser 473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá),ELISA方法檢測ColⅠ、ColⅢ分泌情況。4 CTMP表達(dá)質(zhì)粒對糖尿病小鼠腎臟內(nèi)phospho-Akt(Ser 473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ、FN表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響將CD1小鼠隨機(jī)分為四組:分別為正常對照組(Control組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病+空質(zhì)粒組(DM+V)和糖尿病+CTMP質(zhì)粒組(DM+CTMP),每組10只。質(zhì)粒注射組小鼠在成模4周后,分別給予尾靜脈快速注射pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒或pYr-adshuttle-4質(zhì)粒(1 mg/kg body weight)。此后每隔7天注射一次,共注射4次,之后處死小鼠并收集保存標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測。結(jié)果:1糖尿病小鼠腎臟CTMP表達(dá)降低伴隨phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)增加同正常對照組小鼠相比,糖尿病小鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平分別是正常對照組的4.92、2.84、1.66及7.12倍。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),CTMP主要定位于正常對照組小鼠腎小管上皮細(xì)胞的胞漿,腎小球內(nèi)未見明確表達(dá);而糖尿病小鼠腎臟CTMP表達(dá)較弱,Image-Pro Plus(IPP)軟件分析陽性區(qū)域積分光密度值(integrated optical density,IOD)比正常對照組小鼠降低了63.33%。同樣地,通過Western blot技術(shù)進(jìn)一步檢測了各組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于正常對照組,糖尿病組小鼠腎臟內(nèi)CTMP的表達(dá)下降了37.7%。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA在糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中均有顯著表達(dá),而正常對照組表達(dá)較弱。Western blot進(jìn)一步檢測了蛋白的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠腎臟phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1以及α-SMA的表達(dá)較正常對照組分別上調(diào)了3.66、1.29及2.33倍。Masson染色結(jié)果顯示糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)中可見灶性陽性信號分布,提示出現(xiàn)了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,而正常對照組未見明確陽性表達(dá)。另外,為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖尿病小鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積情況,我們采用免疫組化染色檢測了ColⅢ及FN的表達(dá),結(jié)果提示糖尿病組小鼠腎臟內(nèi)出現(xiàn)顯著的陽性表達(dá),主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的間質(zhì)內(nèi),而正常對照組小鼠腎臟內(nèi)未見明顯表達(dá)。IPP軟件分析ColⅢ及FN陽性區(qū)域積分光密度值(IOD)分別是正常對照組的1.99及2.82倍。2高糖抑制人腎小管上皮細(xì)胞CTMP表達(dá),并誘導(dǎo)phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1、α-SMA的上調(diào)及ColⅠ、ColⅢ的分泌Western blot檢測了0~48 h不同時間點(diǎn)高糖刺激對人腎小管上皮細(xì)胞CTMP、phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1及α-SMA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:CTMP蛋白在高糖刺激0 h時存在一定量的表達(dá),且隨著刺激時間的延長而逐漸減少,并于高糖刺激后24 h達(dá)到最低點(diǎn)。免疫熒光染色顯示CTMP主要定位于人腎小管上皮細(xì)胞的胞漿,高糖刺激后CTMP表達(dá)明顯減弱。相反地,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1及α-SMA蛋白的表達(dá)隨著高糖刺激時間的延長而逐漸升高,并于高糖刺激后24 h達(dá)到高峰,而總Akt的表達(dá)在各個時間點(diǎn)未見顯著差異。ELISA技術(shù)檢測了高糖刺激后0h及48 h兩個時間點(diǎn)細(xì)胞上清液中ColⅠ、ColⅢ的分泌情況。結(jié)果提示高糖刺激后48 h ColⅠ、ColⅢ的分泌較0 h顯著增加。3 CTMP表達(dá)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)下人腎小管上皮細(xì)胞CTMP的下調(diào)以及phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA的過表達(dá)研究結(jié)果揭示pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功上調(diào)了人腎小管上皮細(xì)胞CTMP的表達(dá),經(jīng)Western blot定量分析顯示:與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比,pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒使CTMP的表達(dá)上調(diào)了1.98倍。相反地,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1及α-SMA的表達(dá)分別下調(diào)了35.11%、76.53%及51.59%,而總Akt的表達(dá)未見顯著差異。進(jìn)一步,我們采用ELISA技術(shù)檢測了各組細(xì)胞上清液中ColⅠ和ColⅢ的分泌情況,結(jié)果顯示高糖刺激后48 h ColⅠ、ColⅢ的分泌較0 h顯著增加(P0.05),而經(jīng)pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,ColⅠ、ColⅢ的表達(dá)分別下調(diào)了32.31%及51.83%。4 CTMP表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)糖尿病小鼠腎臟CTMP的表達(dá)并抑制Akt活化、TGF-β1、α-SMA的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比,經(jīng)pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及24 h尿蛋白的水平均顯著降低。RT-PCR結(jié)果分析顯示:糖尿病小鼠腎臟CTMP m RNA的表達(dá)較正常對照組顯著降低,而pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)了CTMP m RNA的表達(dá)。另外,Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達(dá)明顯增加,較pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組上調(diào)了8.84倍;同時phospho-Akt(Ser 473)蛋白的表達(dá)受到顯著抑制,下降了60.00%(P0.05)。同樣地,免疫組化揭示了相似的結(jié)果,IPP軟件分析IOD值顯示:與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比,pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達(dá)上調(diào)了9.43倍,同時伴隨phospho-Akt(Ser473)的表達(dá)下降了54.33%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈注射pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒后,糖尿病小鼠腎臟TGF-β1及α-SMA蛋白的強(qiáng)陽性表達(dá)被顯著抑制。Western blot半定量分析顯示,pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟TGF-β1、α-SMA的蛋白表達(dá)水平與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比分別下調(diào)了76.50%和24.37%。另外,Masson染色發(fā)現(xiàn)糖尿病組以及pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組小鼠腎臟腎小管間質(zhì)均出現(xiàn)了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,而pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未觀察到明顯陽性信號。同時我們通過免疫組化進(jìn)一步檢測了各組小鼠腎臟ColⅢ、FN的表達(dá),發(fā)現(xiàn)pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒組小鼠腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)中ColⅢ、FN的表達(dá)較pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組分別降低了40.43%及51.47%。結(jié)論:1糖尿病小鼠腎臟CTMP低表達(dá)同時伴隨phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)增加及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。2高糖可誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞CTMP低表達(dá)同時伴隨phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)增加及ColⅠ、ColⅢ的分泌。3過表達(dá)的CTMP能夠逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞CTMP低表達(dá),并抑制phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)以及ColⅠ、ColⅢ的分泌。4過表達(dá)的CTMP能抑制糖尿病小鼠腎臟Akt的磷酸化,下調(diào)TGF-β1、α-SMA蛋白的表達(dá)并減輕腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1571512