本文關鍵詞： 標記保留細胞 腎臟干細胞 腎臟祖細胞 腎組織再生 腎臟缺血再灌注損傷 急性腎損傷　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景近年來,隨著人類壽命的延長和現代生活節(jié)奏的改變使患有急、慢性腎臟病患者人數顯著增加。腎臟疾病發(fā)展至終末期后預后極差,目前治療只能依靠透析或腎臟移植來維持患者生命,但是,患者接受透析治療后仍會有許多嚴重并發(fā)癥,腎移植治療也因供體短缺而不能有效開展；同時二者的醫(yī)療費用是非常昂貴的。美國衛(wèi)生組織的數據表明：雖然慢性腎臟病和尿毒癥患者總數只占醫(yī)療人群的9.8%,但他們的醫(yī)療費用卻占美國醫(yī)療預算費用總額的27.6%；每例終末期腎臟病患者消耗醫(yī)療費用約6.18萬美元/年(約41萬元人民幣/年),即使是未接受腎臟替代治療的慢性腎臟病第4期患者也將消耗醫(yī)療費用約1.27萬美元/年(約8萬元人民幣/年)。在我國,雖然這些費用低于美國,但對一個沒有充分醫(yī)療保障的家庭來說難以承受,每年數百億的醫(yī)療花費對國家、社會也是一個沉重的負擔�；谀壳澳I臟疾病治療方面的嚴峻形勢,我們急需尋找新的有效的治療方式。終末期腎臟病的重要特征體現在有功能的健存腎單位的顯著減少,因此理想的治療方法是使受損腎組織形成新的有功能的腎單位。成體腎臟組織再生已經在魚類中得到證實,盡管這種現象在成年哺乳類動物中很少被觀察到。然而,有趣的是,無論是在人類還是在動物中,成體腎臟在受到急性損傷后會立即促使大量腎臟組織細胞再生以恢復受損組織。因此,近年來越來越多的研究顯示成體腎臟可能具有組織修復再生能力,如能進一步明確這些急性腎損傷后腎臟組織修復再生過程中的細胞和分子學基礎,這將為腎臟疾病的治療帶來新的曙光。目前成體腎臟急性損傷之后參與腎臟自身修復的細胞來源尚不明了。其組織修復過程中是否有腎臟固有干細胞或多潛能的腎臟祖細胞參與、是否是已分化的健存的成體腎臟細胞具有再生潛力,現在還存在很大爭議。2003年,Maeshima等人首先用標志保留細胞(label retaining cells, LRCs)的方法去尋找成體腎臟干細胞或祖細胞,并提出在成年大鼠腎臟中存在類似于腎臟祖細胞的腎小管細胞參與到成體腎臟再生修復過程中。隨后一些基于應用標志保留細胞技術的研究相繼報道,在成體腎臟乳頭部、近端小管S3段、腎皮質與外髓質交界處存在腎臟成體干細胞或祖細胞,并參與到腎臟損傷修復過程中。但是,一些基于應用干細胞表面標志物(如CD133和CD24)的研究顯示,人類成體腎臟的祖細胞可能位于鮑曼氏囊壁的尿極,并可以產生新的足細胞和腎小管細胞。另外,最近一些基于譜系示蹤技術的研究認為,健存的小管上皮細胞參與到腎臟的損傷修復中,而不是一些腎臟特異性的干細胞或祖細胞參與其中�？傊�,迄今為止國內外對于成年哺乳類動物腎損傷后組織修復再生的細胞學基礎沒有統(tǒng)一結論,不同的研究技術得到的結論并不一致。在臨床上缺血再灌注引起的腎損傷是引起急性腎損傷的一個主要原因之一。鼠科動物的腎臟缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injured kidney)是急性腎損傷的一個經典動物模型,也是目前世界上公認的研究腎臟損傷修機制的動物模型之一。根據上述背景,本研究通過在新生小鼠腹腔內注射5-溴脫氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)以示蹤腎臟固有的長期的標志保留細胞,并通過在成年小鼠中構建腎臟缺血再灌注損傷模型,進一步探討其在急性腎損傷修復中的作用,明確其是否是真正的成體腎臟干細胞或祖細胞壁龕(stem/progenitor cell niches),為腎臟損傷修復的細胞學來源提供理論基礎。研究目的1.觀察成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后是否具有一定的組織自身修復能力；2.明確成年小鼠腎臟是否存在其新生時標記的LRCs及其分布位置和特征；3.探討腎臟固有的長期標記的LRCs是否參與急性腎臟損傷后腎臟自身修復過程及其作用；明確其是否可以被認為是真正的成體腎臟干細胞或祖細胞壁龕。研究方法1.長期BrdU標記小鼠的模型構建。為標記長期的腎臟固有LRCs,我們在出生后12小時的新生C57BL/6J小鼠腹腔內注射BrdU (50μg/g),每天2次,連續(xù)注射3天。此后,這些新生小鼠在沒有任何醫(yī)療操作的情況下生長至8周齡。2.成年小鼠腎臟缺血再灌注的模型構建。我們選取在新生已標記BrdU的8周齡雄性C57BL/6J小鼠,并隨機分為以下各組：假手術組(n=30),腎臟缺血再灌注組(n=40)。實驗處理如下：小鼠使用水合氯醛麻醉后,打開動物腹腔,使用無創(chuàng)性的微血管夾夾閉雙側腎血管22分鐘,然后去除微血管夾,觀察腎臟再灌注情況,關腹后注射預溫37。C生理鹽水lml以補充手術過程中體液的丟失。假手術組動物行開腹手術后,游離雙側腎蒂組織,但不進行腎血管夾閉,隨后關腹。整個手術操作過程中,小鼠身體保持在一個37。C恒溫電熱毯上。分別于手術后Id、2d、3d、4d、5d、6d、9d、14d、28d處死小鼠,采集血液及心肝腎臟組織。3.腎臟功能評估。處死小鼠前留取血液標本,利用臨床生化室儀器檢測血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。4.腎臟病理檢測。腎臟組織采用常規(guī)HE染色,通過顯微鏡觀察小鼠腎臟缺血再灌注術后成體腎臟損傷修復的組織形態(tài)學變化。腎臟組織采用免疫組織化學染色來計數定位LRCs。除利用常規(guī)的免疫組織化學染色技術定位成體小鼠腎臟BrdU標記的LRCs外,為了更準確清晰的計數BrdU標記,實驗中部分免疫組織化學染色標本未進行常規(guī)的蘇木素細胞核染色。每張病理標本在200倍顯微鏡下隨機選取5個視野,計數視野中BrdU陽性細胞核數,取其平均值計量為BrdU陽性細胞數量。5.雙色免疫熒光檢測。采用腎臟組織冰凍切片進行免疫熒光檢測,使用熒光顯微鏡觀察并攝影羅丹明、FITC標記的熒光二抗,從而間接檢測腎臟組織中BrdU及Ki-67、BrdU及TUNEL、BrdU及LAT的表達。DAPI用于標記腎臟組織細胞核位置。6.統(tǒng)計學處理。服從正態(tài)分布的實驗數據采用均數±標準差(x±s)的方式表示,使用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0處理,采用單因素方差分析進行組間均數的比較,P0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。研究結果1.成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎組織恢復情況1.1腎臟功能恢復情況與假手術組相比,腎臟缺血再灌注組小鼠Scr、BUN在術后1天內顯著升高,于術后24小時達到高峰。與術后基線相比,Scr值在術后24小時末約升高9倍(24小時末Scr vs術后基線Scr175.93±36.61 umol/1 vs 19.53±5.03 umol/1, p 0.05),此后Scr值逐漸降低,到術后第9天恢復正常水平。BUN值變化趨勢基本與Scr值一致。1.2腎臟組織形態(tài)學恢復情況為了更直觀的反應腎臟缺血再灌注損傷后組織修復再生情況,我們進行了腎臟病理HE染色。病理切片顯示術后24小時小鼠腎臟組織可以觀察到典型的腎小管損傷,這些典型的損傷在術后第3天仍然可以觀察到,分布在腎臟組織的皮質、髓質,甚至腎乳頭部。但是,在術后第4天,病理切片上可以明顯地觀察到新生小管細胞大量增殖,這些新生的聚集細胞趨向于形成一種特殊的類似于細胞壁龕樣(the special niches-like structure)的結構。在接來下的3-5天內,腎臟組織結構快速恢復,腎小管擴張、小管上皮細胞崩潰脫落、管腔內刷狀緣消失、管腔基底膜裸露等典型腎小管損傷明顯減少。術后第9天,腎臟皮髓質及乳頭部結構開始趨向正常。2.成年小鼠腎臟長期標記的LRCs分布2.1成年小鼠長期標記的LRCs分布位置及形態(tài)新生小鼠體內標記BrdU 8周后,成年小鼠腎臟內可以觀察到零散分布的BrdU+ LRCs。大多數的LRCs分布在腎小管細胞,少量的LRCs分布在腎組織間質,其中有一部分LRCs是成對出現的；這些成對出現的LRCs約占其總量的21.7±1.5%。另外,我們觀察到在成年小鼠腎臟內長期標記的BrdU+ LRCs的細胞核形態(tài)學特征并不一致,其中一些表現出核碎裂和核溶解現象,約占LRCs總量的10.1±0.9%。2.2成鼠腎臟缺血再灌注損傷后長期標記的LRCs分布位置及計數與假手術組比較,被標記有BrdU的雄性8周齡腎臟缺血再灌注組的小鼠腎組織內BrdU+ LRCs的數量隨腎功能恢復而逐漸減少。其中術后第4天LRCs的數量減少最為顯著,在腎皮質、髓質及腎乳頭部分別減少85±2%,81±5%及95±5%。在術后第28天,腎組織內BrdU+ LRCs很難被檢測到。3.長期標記的LRCs中只有部分細胞積極參與到成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復過程中術后第4天,腎臟缺血再灌注小鼠的腎組織內可見大量腎小管細胞增殖,同時損傷壞死的腎小管明顯減少。在這個損傷修復階段,我們用Ki-67抗體標記新增殖的細胞、用TUNEL抗體標記凋亡壞死細胞。腎臟病理冰凍切片免疫熒光顯示Ki-67標記的新增殖的細胞形成一種類似于壁龕樣的特殊結構,這一結果與腎臟病理HE染色觀察結果一致。但是,并不是所有的BrdU+ LRC s都位于這個結構內,只有那些成對出現的LRCs才趨向于與Ki-67共表達。另外,免疫熒光結果顯示部分零散分布的LRCs趨向于與TUNEL共表達。4.成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復過程中長期標記的LRCs生物學特點為了進一步明確成鼠腎臟LRCs的分化特征,我們選取了近端腎小管分化成熟標記物LTA,以研究LRCs分化程度,并判斷其是否真正具有腎臟干細胞或祖細胞性質。雙色免疫熒光結果顯示損傷早期及正常成鼠腎組織可觀察到一些零散分布的BrdU+LRCs與成熟的近端小管標志物LTA共表達,然而有趣的是,那些成對分布的BrdU+LRCs并未與LTA共表達。研究結論1.本研究通過小鼠缺血再灌注模型證實成鼠急性腎損傷后具有自身修復再生能力,并發(fā)現損傷后大量新生的腎小管細胞趨向于聚集形成一種類似壁龕樣的結構以促進受損腎組織結構恢復。2.本研究結果證實成年小鼠腎臟存在零散分布的少量長期標記的LRCs,其中只有部分LRCs積極參與到成年小鼠腎臟急性損傷修復過程中。這部分LRCs主要表現為在損傷后新增生的細胞中成對出現。3.本研究首次發(fā)現長期標記的LRCs細胞核形態(tài)呈現多樣性,有的甚至表現出核碎裂和核溶解。在小鼠腎臟急性腎損傷修復的同一階段其細胞表型也不一致。因此,我們認為成鼠腎臟中長期標記的LRCs不是單純的一種細胞；并提示在應用其尋找定位腎臟固干細胞的研究中,其生物學特性的復雜性應該被充分重視。4.本研究顯示在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后,早期修復出現前,長期標記的LRCs有的已呈現終末分化狀態(tài),進一步證實并不是腎臟全部的LRCs都可以被認為是慢周期細胞來定位腎臟固有干細胞或是祖細胞壁龕。5.本研究認為只有那些在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后新生細胞中成對出現的LRCs才有可能是真正的腎臟祖細胞壁龕。本研究發(fā)現的成體腎臟長期標記的LRCs呈現的出多重生物學特征,為今后進一步深入探討成體腎臟損傷之后自身修復的細胞學基礎提供了更完善的證據及實驗思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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