本文關(guān)鍵詞： ~(60)Co-γ照射 雄性小鼠不育癥模型 睪丸組織 睪酮 TM3細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的:核能和放射線技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于軍事及各個(gè)生活生產(chǎn)領(lǐng)域。在現(xiàn)有條件下,輻射對(duì)一線戰(zhàn)士、放射線環(huán)境下的工作人員仍存在一定程度的無(wú)法避免的損害效應(yīng)。性腺對(duì)放射線損傷敏感,由此產(chǎn)生的男性不育癥成為當(dāng)今世界日益嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題。研究輻射致男性不育癥的相關(guān)機(jī)制,需要經(jīng)濟(jì)、遺傳信息豐富的不育癥動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物模型成本低廉、近交系多、遺傳信息豐富,更適用于實(shí)驗(yàn)室研究。然而,目前還缺乏理想的輻射致不育癥的小鼠模型。輻射導(dǎo)致持久或不可逆的無(wú)精癥的機(jī)制仍不明確。本研究通過(guò)建立了輻射致雄性小鼠不育癥的模型、輻射致不育癥小鼠生殖系統(tǒng)損傷的檢測(cè)和分析,提出假設(shè):輻射在導(dǎo)致生精細(xì)胞產(chǎn)生損傷的同時(shí),可能也對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞功能造成了影響,使血清睪酮水平下降,影響了精子發(fā)生的微環(huán)境,使精子發(fā)生受到阻滯,造成輻射后持久的無(wú)精癥及不育癥。最后,我們對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞系的輻射后損傷進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄層面、蛋白質(zhì)層面、細(xì)胞生物學(xué)行為的分析。第一部分60Co-γ射線致雄性小鼠不育癥模型的建立方法:65只7周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組(A組,n=5);12 Gy照射組(B組,n=10);6+6 Gy照射組(C組,n=10);10 Gy照射組(D組,n=10);6+4 Gy照射組(E組,n=10);8 Gy照射組(F組,n=10);4+4 Gy照射組(G組,n=10)。觀察分析各組小鼠試驗(yàn)后一般情況及死亡情況(觀察時(shí)間最長(zhǎng)為24周);觀察并分析試驗(yàn)后30天、50天、70天,各組小鼠體重、受孕率。結(jié)果:A、E、F、G組生存時(shí)間較長(zhǎng),D組生存時(shí)間次之,B、C兩組生存時(shí)間最短。照射后30天、50天、70天,D組和E組受孕率均為0%,而F、G組受孕試驗(yàn)均陽(yáng)性。各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)體重與對(duì)照組相比明顯下降。結(jié)論:用60Co-γ射線照射7周齡的C57BL/6雄性小鼠,雙次照射6+4 Gy可以構(gòu)建雄性小鼠的不育癥模型;6+4 Gy組小鼠生存時(shí)間與對(duì)照組相比,無(wú)明顯差異;照射總量為10 Gy的情況下,單次照射組比雙次照射的生存時(shí)間短;12 Gy的照射劑量可以導(dǎo)致小鼠在照射后5周內(nèi)全部死亡;總量≤8Gy的照射劑量,不足以構(gòu)建雄性小鼠不育癥模型;輻射對(duì)小鼠的體重有影響。第二部分60Co-γ射線致雄性小鼠不育癥模型的損傷分析方法:216只7周齡的雄性C57BL/6小鼠完全隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(A組,n=54);6+4 Gy照射組(B組,n=54);4+4 Gy照射組(C組,n=54);6 Gy照射組(D組,n=54)。第30天、50天、70天,對(duì)睪丸指數(shù)進(jìn)行分析;對(duì)睪丸石蠟切片HE染色進(jìn)行觀察和精子發(fā)生評(píng)估;對(duì)PLZF陽(yáng)性標(biāo)記的精原干細(xì)胞(免疫組化法)進(jìn)行計(jì)數(shù);對(duì)血清inhibin B、睪酮、FSH水平進(jìn)行測(cè)定(ELISA法);對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物3β-HSD蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)(Western Blot法)。結(jié)果:照射組小鼠的睪丸指數(shù)均低于對(duì)照組。各照射組睪丸組織Johnsen評(píng)分與對(duì)照組相比均下降,呈照射劑量-效應(yīng)關(guān)系。B組在第30天、50天、70天,PLZF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組水平,余組在部分時(shí)間點(diǎn)差異不明顯。第30天、50、70天,B組血清inhibin B水平低于與對(duì)照組,其余照射組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第30天、50天,C組與D組血清FSH水平比對(duì)照組高,B組無(wú)顯著差異;第70天,C組的血清FSH水平比對(duì)照組高,余組無(wú)顯著差異。第30天、50天、70天,各照射組血清睪酮水平比對(duì)照組明顯下降。第30天,各照射組3β-HSD表達(dá)下降,呈照射劑量-效應(yīng)關(guān)系。第50天、70天,各照射組的3β-HSD表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。結(jié)論:輻射導(dǎo)致小鼠睪丸指數(shù)下降、精子發(fā)生功能損傷,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中,6+4 Gy照射后,小鼠睪丸中精原干細(xì)胞仍存在并維持增殖,但精子發(fā)生出現(xiàn)阻滯,表現(xiàn)為無(wú)精癥、不育癥。因此,6+4 Gy的γ射線的照射可以成功構(gòu)建雄性小鼠不育癥模型。各照射組的睪酮水平均下降,提示睪酮可能是導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯的微環(huán)境因素之一。血清inhibin B水平可以提示不育癥模型組小鼠的生殖功能的損傷。睪丸組織3β-HSD蛋白水平可以提示照射較早期睪丸損傷的程度。第三部分60Co-γ射線致睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3損傷的研究方法:hCG刺激試驗(yàn):TM3細(xì)胞鋪12孔板,加藥組hCG濃度為1 IU/ml、10 IU/ml,對(duì)照組不加hCG。在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72小時(shí)取細(xì)胞培養(yǎng)基上清液檢測(cè)睪酮值。TM3細(xì)胞輻射損傷試驗(yàn):TM3細(xì)胞鋪板后分組進(jìn)行60Co-γ射線照射,劑量分別為:3 Gy、6 Gy、9 Gy,對(duì)照組不輻照。于試驗(yàn)第24h、48h、72h觀察各組細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞法)、氧化損傷(ELISA)、睪酮分泌(ELISA)、睪酮合成關(guān)鍵因子(St AR、P450scc、P450c17和3β-HSD)的轉(zhuǎn)錄水平(q PCR法)。試驗(yàn)第24、48、72、96、120、144小時(shí),觀察細(xì)胞增殖情況(MTS法)。結(jié)果:hCG刺激試驗(yàn)中,細(xì)胞培養(yǎng)48h,添加hCG細(xì)胞組的睪酮濃度明顯高于對(duì)照組;72小時(shí),添加1 IU/ml hCG細(xì)胞組的睪酮濃度明顯高于對(duì)照組。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明,第24小時(shí),3 Gy和6 Gy組的早期凋亡細(xì)胞百分比上升;第48小時(shí)后,在6 Gy和9 Gy組的上升;第72小時(shí),各照射組的均上升。第24小時(shí),僅9 Gy組晚期凋亡細(xì)胞百分比上升;第48小時(shí)后,僅6 Gy組的上升;第72小時(shí),6 Gy及9 Gy組的上升。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,72小時(shí)開(kāi)始,6 Gy及9 Gy組OD490值低于對(duì)照組,144~120小時(shí),各照射組OD490值均低于對(duì)照組。氧化損傷實(shí)驗(yàn)中,3 Gy組8-OHd G與對(duì)照組相比無(wú)差異;6 Gy組8-OHd G濃度在第72小時(shí)高于對(duì)照組;9 Gy組8-OHd G濃度在第24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均顯著高于對(duì)照組。在重復(fù)3次的睪酮水平檢測(cè)中,對(duì)照組均可測(cè)出睪酮濃度;而照射組中,僅9 Gy組在第24小時(shí)可測(cè)得睪酮濃度,高于對(duì)照組,9 Gy組余時(shí)間點(diǎn)及余照射組中測(cè)得的值因低于ELISA試劑盒可測(cè)范圍,無(wú)法測(cè)出3次睪酮濃度。各組相對(duì)St AR、P450scc、3β-HSD轉(zhuǎn)錄水平在第72小時(shí)均低于對(duì)照組;第72小時(shí),3 Gy組的P450c17轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比,6 Gy組轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組,而9 Gy水平低于對(duì)照組。結(jié)論:3Gy的60Co-γ射線就能誘導(dǎo)TM3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖;≥6Gy的輻照還能引起明顯的氧化損傷;9Gy的輻射對(duì)4種睪酮關(guān)鍵合成因子(St AR、P450scc、P450c17及3β-HSD)的轉(zhuǎn)錄均有明顯抑制作用。創(chuàng)新點(diǎn)與小結(jié)首先,我們成功地制備了不育癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、死亡率低的輻射致雄性小鼠不育癥模型,為輻射導(dǎo)致男性不育癥的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)工具。其次,通過(guò)Johnsen評(píng)分、PLZF陽(yáng)性精原干細(xì)胞計(jì)數(shù)的分析,我們發(fā)現(xiàn)不育癥小鼠維持較長(zhǎng)時(shí)間癥狀的原因是精子發(fā)生的阻滯,而不是精原干細(xì)胞的缺失;導(dǎo)致精子發(fā)生恢復(fù)阻滯的原因不是精原干細(xì)胞功能異常,而是精子發(fā)生的微環(huán)境受到了損傷。第三,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在較低照射劑量(3Gy)的輻照下,睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和生物功能均受到影響,提示精子發(fā)生阻滯的原因之一可能是睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損后使睪酮合成和分泌下降,從而改變了精子發(fā)生的微環(huán)境,精原細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟發(fā)生了障礙,導(dǎo)致了無(wú)精癥的發(fā)生。以往研究者們對(duì)小鼠輻射后精子發(fā)生恢復(fù)是否存在阻滯現(xiàn)象;精子發(fā)生阻滯的原因是精原干細(xì)胞缺失,還是精子發(fā)生的微環(huán)境改變;睪丸間質(zhì)細(xì)胞是否能耐受低-中劑量的輻射等一系列問(wèn)題,均存在爭(zhēng)議。我們的研究從新的視角對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行了觀察分析,為研究輻射導(dǎo)致男性不育癥的機(jī)制研究打下基礎(chǔ),提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[Abstract]:The research background and purpose : The nuclear energy and radiation technologies are increasingly used in military and life - producing fields . Under the existing conditions , the radiation exposure to the first - line warrior and the staff in the radiation environment has a certain degree of damage effect . The mechanism of radiation - induced infertility is not clear . The results showed that the survival time of 6 + 4 Gy group was shorter than that of control group . The testis index was analyzed on day 30 , 50 days and 70 days . HE staining was performed on paraffin sections of the testis . The spermatogonial stem cells ( immunohistochemistry ) of PLZF positive marker were counted ; the serum albumin B , testosterone and FSH level were measured ( ELISA method ) ; and the level of 3 . beta . - HSD protein was detected by Western Blot . Results : Compared with the control group , the levels of testosterone in the testis of mice were significantly lower than those in the control group . The levels of testosterone in the testes of each irradiation group were lower than those in the control group . The levels of apoptosis ( flow cytometry ) , oxidative damage ( ELISA ) , testosterone secretion ( ELISA ) , testosterone synthesis critical factor ( St AR , P450 scc , P450 c17 and 3尾 - HSD ) were observed at 48h and 72h ( q - PCR ) . Results : After 48 hours , the levels of testosterone in groups of 6 Gy and 9 Gy were significantly higher than those in the control group . The levels of 8 - OHd G in the group were significantly higher than those in the control group after 48 hours . Third , through in vitro experiments , we have found that the cause of the recurrence of spermatids is not the function of spermatogonial stem cells , but not the deficiency of spermatogonial stem cells .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R-332;R698.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 段四芬,薛寧;第二屆中國(guó)中醫(yī)不育癥學(xué)術(shù)大會(huì)在揚(yáng)州召開(kāi)[J];中華男科學(xué);2000年04期

2 毓芩;;父親的不育癥可遺傳給后代[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);2000年01期

3 ;首屆高級(jí)不孕及不育癥診治新技術(shù)培訓(xùn)班即將舉辦[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2001年09期

4 毓芩;父親的不育癥可遺傳給后代[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);2002年02期

5 ;全國(guó)不孕、不育癥新技術(shù)、新進(jìn)展培訓(xùn)班(報(bào)名通知)[J];生殖與避孕;2003年04期

6 ;吃水果可治不育癥[J];廣西農(nóng)業(yè)機(jī)械化;2003年06期

7 ;第二屆全國(guó)不育癥研討會(huì)通知[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

8 ;第二屆全國(guó)不育癥研討會(huì)通知[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

9 王旭初;潘磊;張平;謝葆冬;劉文軒;王國(guó)華;鞏祥勝;潘天明;;中西醫(yī)結(jié)合治療不育癥110例[J];中醫(yī)雜志;2008年01期

10 ;《全國(guó)第三屆不育癥暨保留生育功能微創(chuàng)手術(shù)研討會(huì)》征文通知[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2008年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 ;第四屆全國(guó)不育癥暨保留生育功能微創(chuàng)手術(shù)研討會(huì)日程表[A];第四屆全國(guó)不孕癥暨保留生育功能微創(chuàng)手術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 ;全國(guó)第三屆不育癥暨保留生育功能微創(chuàng)手術(shù)研討會(huì)日程表[A];全國(guó)第三屆不育癥暨保留生育功能微創(chuàng)手術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

3 鄭小陸;;中西醫(yī)結(jié)合治療不育癥的體會(huì)[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（下冊(cè)）[C];2001年

4 邢發(fā)樞;郁兆存;;男性免疫性不育癥的中西醫(yī)結(jié)合治療(附89例報(bào)告)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)男科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

5 王傳航;;不育癥的性功能問(wèn)題[A];首屆岐黃男科論壇大會(huì)報(bào)告及論文匯編[C];2011年

6 王植柔;;生殖輔助技術(shù)在不育癥的應(yīng)用和展望[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

7 胡金山;;邳州100例不育癥調(diào)查報(bào)告[A];21世紀(jì)男科學(xué)——中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)男科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2004年

8 洪龍海;高紅玲;楊愛(ài)梅;童秀麗;吳芳蘭;童建武;張曉春;;123例不育癥的近期治療效果[A];中南六省性學(xué)會(huì)第一次學(xué)術(shù)年會(huì)暨湖北省性學(xué)會(huì)第二屆第一次學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2003年

9 袁少英;覃湛;盧玉忠;王偉光;張兆磊;李慎果;;針挑治療生殖道感染性不育癥的臨床療效觀察[A];2011中國(guó)針灸學(xué)會(huì)年會(huì)論文集（摘要）[C];2011年

10 黃榕康;;中醫(yī)藥治療感染性不育癥的臨床研究[A];全國(guó)性與生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 王增;婦女飲咖啡易患不育癥[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2008年

2 雷坤;廣東新婚家庭14.7%患不育癥？[N];廣州日?qǐng)?bào);2008年

3 空軍總醫(yī)院主任醫(yī)師 胡海翔;改善不育癥 中醫(yī)藥不可少[N];健康報(bào);2013年

4 遼寧省計(jì)劃生育科研院 郭廷超;患不育癥正規(guī)診療才是明智之舉[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2006年

5 主任醫(yī)師 方雪;精不液化——不育癥誘因之一[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2008年

6 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科 韓強(qiáng);不育癥治療最好選夏季[N];健康時(shí)報(bào);2009年

7 葛秋芳;體外受精或使先天性不育癥傳給下一代[N];新華每日電訊;2008年

8 周 穎 本報(bào)記者;安義有個(gè)張代表[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2005年

9 欣華;水果可治療不育癥[N];中國(guó)消費(fèi)者報(bào);2003年

10 河北 教授 裴林;不育——不能只責(zé)怪妻子[N];家庭醫(yī)生報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 張燁敏;輻射致小鼠不育癥模型的建立及睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 楊文濤;弱精性不育癥的氧自由基機(jī)理探討及中醫(yī)藥治療研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2003年

3 程丹;Attractin在不育癥男性中的差異性表達(dá)意義與影響生育機(jī)制的初步探討[D];華中科技大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 辛榮華;抗凝方治療男性免疫性不育癥的臨床研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2011年

2 鄒如政;生精1號(hào)對(duì)少弱精子不育癥精子參數(shù)影響的研究[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2004年

3 王慧禹;血管緊張素Ⅱ?qū)Σ挥Y精子功能的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

4 孫小勇;秦國(guó)政教授治療男性免疫性不育癥臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2012年

，

本文編號(hào)：1547132