本文關鍵詞： ~(60)Co-γ照射 雄性小鼠不育癥模型 睪丸組織 睪酮 TM3細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與目的:核能和放射線技術越來越多地應用于軍事及各個生活生產(chǎn)領域。在現(xiàn)有條件下,輻射對一線戰(zhàn)士、放射線環(huán)境下的工作人員仍存在一定程度的無法避免的損害效應。性腺對放射線損傷敏感,由此產(chǎn)生的男性不育癥成為當今世界日益嚴峻的社會問題。研究輻射致男性不育癥的相關機制,需要經(jīng)濟、遺傳信息豐富的不育癥動物模型。嚙齒類動物模型成本低廉、近交系多、遺傳信息豐富,更適用于實驗室研究。然而,目前還缺乏理想的輻射致不育癥的小鼠模型。輻射導致持久或不可逆的無精癥的機制仍不明確。本研究通過建立了輻射致雄性小鼠不育癥的模型、輻射致不育癥小鼠生殖系統(tǒng)損傷的檢測和分析,提出假設:輻射在導致生精細胞產(chǎn)生損傷的同時,可能也對睪丸間質細胞的細胞功能造成了影響,使血清睪酮水平下降,影響了精子發(fā)生的微環(huán)境,使精子發(fā)生受到阻滯,造成輻射后持久的無精癥及不育癥。最后,我們對體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質細胞TM3細胞系的輻射后損傷進行了轉錄層面、蛋白質層面、細胞生物學行為的分析。第一部分60Co-γ射線致雄性小鼠不育癥模型的建立方法:65只7周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機分為7組:正常對照組(A組,n=5);12 Gy照射組(B組,n=10);6+6 Gy照射組(C組,n=10);10 Gy照射組(D組,n=10);6+4 Gy照射組(E組,n=10);8 Gy照射組(F組,n=10);4+4 Gy照射組(G組,n=10)。觀察分析各組小鼠試驗后一般情況及死亡情況(觀察時間最長為24周);觀察并分析試驗后30天、50天、70天,各組小鼠體重、受孕率。結果:A、E、F、G組生存時間較長,D組生存時間次之,B、C兩組生存時間最短。照射后30天、50天、70天,D組和E組受孕率均為0%,而F、G組受孕試驗均陽性。各組小鼠各時間點體重與對照組相比明顯下降。結論:用60Co-γ射線照射7周齡的C57BL/6雄性小鼠,雙次照射6+4 Gy可以構建雄性小鼠的不育癥模型;6+4 Gy組小鼠生存時間與對照組相比,無明顯差異;照射總量為10 Gy的情況下,單次照射組比雙次照射的生存時間短;12 Gy的照射劑量可以導致小鼠在照射后5周內(nèi)全部死亡;總量≤8Gy的照射劑量,不足以構建雄性小鼠不育癥模型;輻射對小鼠的體重有影響。第二部分60Co-γ射線致雄性小鼠不育癥模型的損傷分析方法:216只7周齡的雄性C57BL/6小鼠完全隨機分為4組:正常對照組(A組,n=54);6+4 Gy照射組(B組,n=54);4+4 Gy照射組(C組,n=54);6 Gy照射組(D組,n=54)。第30天、50天、70天,對睪丸指數(shù)進行分析;對睪丸石蠟切片HE染色進行觀察和精子發(fā)生評估;對PLZF陽性標記的精原干細胞(免疫組化法)進行計數(shù);對血清inhibin B、睪酮、FSH水平進行測定(ELISA法);對睪丸間質細胞標志物3β-HSD蛋白水平進行檢測(Western Blot法)。結果:照射組小鼠的睪丸指數(shù)均低于對照組。各照射組睪丸組織Johnsen評分與對照組相比均下降,呈照射劑量-效應關系。B組在第30天、50天、70天,PLZF陽性細胞計數(shù)明顯低于對照組水平,余組在部分時間點差異不明顯。第30天、50、70天,B組血清inhibin B水平低于與對照組,其余照射組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。第30天、50天,C組與D組血清FSH水平比對照組高,B組無顯著差異;第70天,C組的血清FSH水平比對照組高,余組無顯著差異。第30天、50天、70天,各照射組血清睪酮水平比對照組明顯下降。第30天,各照射組3β-HSD表達下降,呈照射劑量-效應關系。第50天、70天,各照射組的3β-HSD表達水平與對照組相比沒有明顯差異。結論:輻射導致小鼠睪丸指數(shù)下降、精子發(fā)生功能損傷,呈劑量-效應關系。其中,6+4 Gy照射后,小鼠睪丸中精原干細胞仍存在并維持增殖,但精子發(fā)生出現(xiàn)阻滯,表現(xiàn)為無精癥、不育癥。因此,6+4 Gy的γ射線的照射可以成功構建雄性小鼠不育癥模型。各照射組的睪酮水平均下降,提示睪酮可能是導致精子發(fā)生阻滯的微環(huán)境因素之一。血清inhibin B水平可以提示不育癥模型組小鼠的生殖功能的損傷。睪丸組織3β-HSD蛋白水平可以提示照射較早期睪丸損傷的程度。第三部分60Co-γ射線致睪丸間質細胞TM3損傷的研究方法:hCG刺激試驗:TM3細胞鋪12孔板,加藥組hCG濃度為1 IU/ml、10 IU/ml,對照組不加hCG。在細胞培養(yǎng)24、48、72小時取細胞培養(yǎng)基上清液檢測睪酮值。TM3細胞輻射損傷試驗:TM3細胞鋪板后分組進行60Co-γ射線照射,劑量分別為:3 Gy、6 Gy、9 Gy,對照組不輻照。于試驗第24h、48h、72h觀察各組細胞凋亡情況(流式細胞法)、氧化損傷(ELISA)、睪酮分泌(ELISA)、睪酮合成關鍵因子(St AR、P450scc、P450c17和3β-HSD)的轉錄水平(q PCR法)。試驗第24、48、72、96、120、144小時,觀察細胞增殖情況(MTS法)。結果:hCG刺激試驗中,細胞培養(yǎng)48h,添加hCG細胞組的睪酮濃度明顯高于對照組;72小時,添加1 IU/ml hCG細胞組的睪酮濃度明顯高于對照組。細胞凋亡實驗表明,第24小時,3 Gy和6 Gy組的早期凋亡細胞百分比上升;第48小時后,在6 Gy和9 Gy組的上升;第72小時,各照射組的均上升。第24小時,僅9 Gy組晚期凋亡細胞百分比上升;第48小時后,僅6 Gy組的上升;第72小時,6 Gy及9 Gy組的上升。細胞增殖實驗中,72小時開始,6 Gy及9 Gy組OD490值低于對照組,144~120小時,各照射組OD490值均低于對照組。氧化損傷實驗中,3 Gy組8-OHd G與對照組相比無差異;6 Gy組8-OHd G濃度在第72小時高于對照組;9 Gy組8-OHd G濃度在第24小時、48小時、72小時均顯著高于對照組。在重復3次的睪酮水平檢測中,對照組均可測出睪酮濃度;而照射組中,僅9 Gy組在第24小時可測得睪酮濃度,高于對照組,9 Gy組余時間點及余照射組中測得的值因低于ELISA試劑盒可測范圍,無法測出3次睪酮濃度。各組相對St AR、P450scc、3β-HSD轉錄水平在第72小時均低于對照組;第72小時,3 Gy組的P450c17轉錄水平與對照組相比,6 Gy組轉錄水平高于對照組,而9 Gy水平低于對照組。結論:3Gy的60Co-γ射線就能誘導TM3細胞的細胞凋亡、抑制細胞增殖;≥6Gy的輻照還能引起明顯的氧化損傷;9Gy的輻射對4種睪酮關鍵合成因子(St AR、P450scc、P450c17及3β-HSD)的轉錄均有明顯抑制作用。創(chuàng)新點與小結首先,我們成功地制備了不育癥持續(xù)時間長、死亡率低的輻射致雄性小鼠不育癥模型,為輻射導致男性不育癥的機制研究提供了實驗工具。其次,通過Johnsen評分、PLZF陽性精原干細胞計數(shù)的分析,我們發(fā)現(xiàn)不育癥小鼠維持較長時間癥狀的原因是精子發(fā)生的阻滯,而不是精原干細胞的缺失;導致精子發(fā)生恢復阻滯的原因不是精原干細胞功能異常,而是精子發(fā)生的微環(huán)境受到了損傷。第三,通過體外實驗,我們發(fā)現(xiàn)在較低照射劑量(3Gy)的輻照下,睪丸間質細胞增殖和生物功能均受到影響,提示精子發(fā)生阻滯的原因之一可能是睪丸間質細胞受損后使睪酮合成和分泌下降,從而改變了精子發(fā)生的微環(huán)境,精原細胞進一步分化成熟發(fā)生了障礙,導致了無精癥的發(fā)生。以往研究者們對小鼠輻射后精子發(fā)生恢復是否存在阻滯現(xiàn)象;精子發(fā)生阻滯的原因是精原干細胞缺失,還是精子發(fā)生的微環(huán)境改變;睪丸間質細胞是否能耐受低-中劑量的輻射等一系列問題,均存在爭議。我們的研究從新的視角對這些問題進行了觀察分析,為研究輻射導致男性不育癥的機制研究打下基礎,提供了實驗數(shù)據(jù)。
[Abstract]:The research background and purpose : The nuclear energy and radiation technologies are increasingly used in military and life - producing fields . Under the existing conditions , the radiation exposure to the first - line warrior and the staff in the radiation environment has a certain degree of damage effect . The mechanism of radiation - induced infertility is not clear . The results showed that the survival time of 6 + 4 Gy group was shorter than that of control group . The testis index was analyzed on day 30 , 50 days and 70 days . HE staining was performed on paraffin sections of the testis . The spermatogonial stem cells ( immunohistochemistry ) of PLZF positive marker were counted ; the serum albumin B , testosterone and FSH level were measured ( ELISA method ) ; and the level of 3 . beta . - HSD protein was detected by Western Blot . Results : Compared with the control group , the levels of testosterone in the testis of mice were significantly lower than those in the control group . The levels of testosterone in the testes of each irradiation group were lower than those in the control group . The levels of apoptosis ( flow cytometry ) , oxidative damage ( ELISA ) , testosterone secretion ( ELISA ) , testosterone synthesis critical factor ( St AR , P450 scc , P450 c17 and 3尾 - HSD ) were observed at 48h and 72h ( q - PCR ) . Results : After 48 hours , the levels of testosterone in groups of 6 Gy and 9 Gy were significantly higher than those in the control group . The levels of 8 - OHd G in the group were significantly higher than those in the control group after 48 hours . Third , through in vitro experiments , we have found that the cause of the recurrence of spermatids is not the function of spermatogonial stem cells , but not the deficiency of spermatogonial stem cells .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R698.2

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