本文關鍵詞： 時間分辨熒光免疫分析 膜性腎病 特發(fā)性膜性腎病 磷脂酶A2受體　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的:建立抗PLA2R抗體的超靈敏定量檢測方法,改進抗PLA2R抗體檢測在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應用。研究內容:(1)重組PLA2R的表達、純化和鑒定。(2)抗PLA2R抗體的定量標準品的制備。(3)Eu3+標記抗人IgG抗體的制備。(4)建立抗PLA2R抗體時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)檢測方法,并進行反應條件的優(yōu)化選擇和方法學的評估。(5)將此技術應用于膜性腎病的研究,是否可以準確的評估抗PLA2R抗體在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應用價值,是否可能通過不同的閾值對膜性腎病的程度和類型進行區(qū)分。研究方法:(1)采用帶有flag標簽的PLA2R質粒進行重組PLA2R的表達、用偶聯(lián)有flag抗體的柱料進行純化、鑒定重組PLA2R的分子量和免疫反應活性。(2)篩選出一個含高濃度抗PLA2R抗體的血清,采用尿素解離結合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗體,并進行IgG抗體定量,推算出原血清中抗PLA2R抗體的濃度,將此已知抗PLA2R抗體濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R抗體的標準品。(3)建立抗PLA2R抗體TRFIA檢測方法,并從包被濃度的選擇、標記抗體稀釋度的選擇、血清稀釋度的選擇、反應時間的選擇等各方面進行了優(yōu)化。從批內批間精密度、靈敏度、回收率、測量范圍等方面對建立的TRFIA方法進行評價。(4)用建立的TRFIA試劑盒檢測167腎病患者(其中特發(fā)性模性腎病77例,IgA腎病53例,紅斑狼瘡腎病16例,其它腎病21例)血清及286例健康體檢者血清中PLA2R自身抗體濃度,進行參考范圍的建立和診斷價值分析。創(chuàng)新性成果:(1)制備了具有特異性免疫反應活性的重組PLA2R抗原,可用于抗PLA2R抗體的檢測。(2)制備了抗PLA2R抗體標準品,為抗PLA2R抗體檢測的量化提供了依據。設置的抗PLA2R抗體的標準品濃度分別為0 μg/ml、0.17 μg/ml、0.68 μg/ml、3.42μg/ml、17.1 μg/ml、68.4μng/ml、343 μg/ml。(3)目前抗PLA2R抗體的血清學檢測尚處于理論研究階段,主要采用western-blot方法,少數研究者采用間接免疫熒光法和ELISA方法,但這些方法靈敏度有限,主要用于定性或半定量分析,而且操作復雜費時,另外目前還沒有商品化的抗PLA2R抗體的定量檢測試劑盒。本研究建立的TRFIA方法檢測抗PLA2R抗體具有良好的檢測性能,其靈敏度為0.02μg/ml,檢測上限為343μg/ml,有效檢測范圍為0.02μg/mL～343 μg/ml,3份標本的回收率均值為98.96%,批內CV%(n=20)分別為6.38%、5.55%、4.88%,批間(n=8)CV%分別為7.69%、6.23%、6%,均10%。本研究意義在于為膜性腎病患者提供一個除穿刺以外的可臨床實際應用的血清學診斷指標,為該病的診斷、活動性的判斷、治療時機的把握、藥物的選擇及療效判斷提供一個理想的血清學標志物。使該病情的診斷和監(jiān)控更為方便,患者容易接受,有利于特發(fā)性膜性腎病的早期診斷和治療。(4)通過設定不同的閾值可以將正常人、IgA腎病、紅斑狼瘡腎病、IMN、其它腎病進行區(qū)分,0～0.91 μg/ml為正常參考值,35.8%的IgA腎病、50%的紅斑狼瘡腎病、14.3%其它腎病、88.3%的IMN的抗PLA2R抗體的值0.91 μg/ml,IMN的檢測特異性為90.9%;若以大于2.025 μg/ml為IMN的界定值(根據ROC曲線),非IMN腎病均陰性,77例IMN中57例為陽性,檢測靈敏度為74%,特異性為100%。
[Abstract]:Objective : To establish an ultra - sensitive quantitative detection method of anti - PLA2R antibody and to improve the application of anti - PLA2R antibody in idiopathic membranous nephropathy , secondary membranous nephropathy and other renal diseases . ( 4 ) ELISA kit was used to detect the concentration of PLA2R in serum of 167 patients with nephrotic syndrome ( including 77 patients with idiopathic modular nephropathy , 53 with IgA nephropathy , 16 with lupus nephritis , 21 with other nephropathy ) and 286 healthy controls . ( 3 ) The serological test of anti - PLA2R antibody is still in the theoretical research stage , mainly by western - blot method , but the sensitivity of these methods is limited . It is mainly used for qualitative or semi - quantitative analysis . The detection limit is 0.02渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml , the effective detection range is 0 . 02 渭g / mL ~ 343 渭g / ml . ( 4 ) By setting different thresholds , normal persons , IgA nephropathy , lupus nephritis nephropathy , IMN and other renal diseases were distinguished , 0 - 0.91 渭g / ml was normal reference value , 35.8 % IgA nephropathy , 50 % lupus nephritis nephropathy , 14.3 % other renal disease , 88.3 % IMN anti - PLA2R antibody was negative , 57 of 77 IMN were positive , the detection sensitivity was 74 % , specificity was 100 % .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.6;R692

【參考文獻】

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本文編號：1544474