本文關鍵詞： 急性腎損傷 缺血再灌注損傷 VEGF-C NRP-2 血清剝奪 凋亡 自噬　出處：《華中科技大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的探討血管內(nèi)皮生長因C(VEGF-C)在腎缺血再灌注動物模型中表達的變化以及VEGF-C及其受體NRP-2對血清剝奪誘導的大鼠近端腎小管上皮細胞(NRK52E)凋亡和自噬的作用及機制。 方法(1)觀察小鼠腎缺血再灌注模型中VEGF-C的表達變化：構建小鼠腎缺血再灌注模型,收集并檢測各組血清總Scr, BUN的水平,PAS染色觀察腎臟的病理損傷程度,免疫組織化學法及Western Blot檢測VEGF-C的表達與分布。(2)觀察VEGF-C及受體NRP-2對血清剝奪誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響：血清剝奪不同時間刺激NRK52E細胞,Western Blot檢測血清剝奪不同時間點激活型caspase3和總caspase3的表達變化；用小分子siRNA干擾技術分別沉默VEGF-C, NRP-2的表達,利用流式細胞學方法檢測VEGF-C, NRP-2沉默對血清剝奪誘導細胞凋亡率的影響,Western Blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達變化；用不同濃度的重組VEGF-C因子預處理細胞,利用CCK-8法檢測外源性加入VEGF-C對血清剝奪誘導的細胞活性改變的影響。(3)觀察VEGF-C及受體NRP-2對血清剝奪誘導的腎小管上皮細胞自噬的影響：血清剝奪不同時間刺激NRK52E細胞,Western Blot檢測血清剝奪不同時間點LC3的表達；細胞免疫熒光檢測LC3表達及分布情況；透射電鏡觀察血清剝奪誘導后細胞的超微結構形態(tài)改變；用小分子siRNA干擾技術分別沉默VEGF-C, NRP-2的表達,Western Blot檢測VEGF-C, NRP-2沉默對血清剝奪誘導LC3的表達變化的影響；在血清剝奪的條件下,加入不同濃度的巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1), CCK-8法檢測細胞活性的改變；Western Blot檢測加入Bafilomycin A1后VEGF-C沉默對血清剝奪誘導LC3的表達變化的影響。 結果(1)缺血再灌注損傷后,小鼠血肌酐和尿素氮上升,缺血再灌注24h時腎功能損傷最明顯,而缺血再灌注48h時腎功能已經(jīng)有部分恢復。與假手術組比較,缺血再灌注損傷后腎組織可見腎小管管腔擴張,伴管型形成,腎小管上皮細胞腫脹壞死及空泡變性,刷狀緣壞死脫落,并且伴有炎性細胞侵潤,而腎小球未見明顯的病變。免疫組織化學結果顯示,與假手術組比較,缺血再灌注24h組小鼠腎臟VEGF-C表達增加,并且主要表達在腎臟皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)部的腎小管。Western blot結果顯示隨著缺血后再灌注時間的延長,小鼠腎組織VEGF-C蛋白的表達逐漸增加。(2)隨著血清剝奪時間的延長,細胞激活型caspase3的表達增高,而總caspase3的表達減少；利用siRNA技術分別沉默NRK52E細胞VEGF-C和NRP-2的表達后,血清剝奪誘導的細胞凋亡水平均明顯增加；血清剝奪刺激后,Bcl-2蛋白表達下降,而沉默VEGF-C能進一步降低Bcl-2蛋白的表達；外源性加入VEGF-C能抑制血清饑餓誘導的細胞活力下降。(3)隨著血清剝奪時間的延長,LC3II蛋白的表達逐漸增加；血清剝奪誘導后LC3在胞漿點狀聚集增多；透射電鏡下觀察到血清剝奪誘導后細胞線粒體腫脹,細胞內(nèi)空泡變性顯著增多,并可以見到降解自噬囊泡；分別沉默VEGF-C和NRP-2的表達后,能進一步增加血清剝奪誘導的LC3II的蛋白表達；在血清剝奪環(huán)境下,Bafilomycin A1能使細胞活力進一步降低,并呈濃度依耐性；加入Bafilomycin A1后,VEGF-C干擾組的細胞LC3表達變化的比值均低于對照siRNA組。 結論腎缺血再灌注損傷后腎臟組織中VEGF-C的表達上升,提示VEGF-C與腎缺血再灌注損傷之間存在著密切的關系；VEGF-C及其受體NRP-2能維持腎小管上皮細胞在血清剝奪環(huán)境下的存活,減少腎小管上皮細胞凋亡：VEGF-C及其受體NRP-2參與調(diào)控血清剝奪誘導的細胞自噬。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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