本文關(guān)鍵詞： 腎臟AA樣變 CD36 SAA 自噬　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:腎臟AA淀粉樣變性(amyloidosis)是由多種慢性疾病狀態(tài)所致的,突出特點(diǎn)是淀粉樣物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外沉積,通過各種途徑誘導(dǎo)腎臟組織結(jié)構(gòu)與功能異常�；颊咧饕憩F(xiàn)為腎病綜合征,隨病情進(jìn)展晚期表現(xiàn)為明顯腎衰竭癥狀,最終導(dǎo)致死亡。通過更好地控制炎癥能明顯改善其預(yù)后,但目前這個(gè)疾病的發(fā)病機(jī)制是不清楚的,更缺乏有效的治療。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(CD36)屬于B族清道夫受體,是連接機(jī)體脂代謝和炎癥的重要膜蛋白,被認(rèn)為是治療代謝性疾病的重要靶點(diǎn)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)CD36參與了血清淀粉樣蛋白A(SAA)的攝取及SAA誘導(dǎo)的炎性因子的分泌過程。本研究旨在探討CD36是否參與了腎臟AA淀粉樣變所致的腎臟損害及其作用機(jī)制。方法:第一部分:選取8周齡野生型(wild type,WT)小鼠,隨機(jī)分為兩組,0.5ml 10%酪蛋白(Casein)隔日皮下注射為實(shí)驗(yàn)組(Casein組),對(duì)照組(Control組)給予等量生理鹽水隔日皮下注射。按上述處理15周后先常規(guī)收集小鼠24h尿液,再采集眶靜脈血離心取血清,最后分離腎臟組織。SAA濃度檢測采用了酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒。小鼠腎臟淀粉樣變模型的確認(rèn)采用了剛果紅染色;實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟組織CD36的表達(dá)同時(shí)采用了免疫印跡(Western blot)和免疫組化兩種方法檢測。第二部分:選取8周齡野生型(WT)小鼠和CD36-/-小鼠隨機(jī)分為三組,0.5ml10%酪蛋白(casein)隔日皮下注射為實(shí)驗(yàn)組wtcasein(+)和cd36-/-casein(+),對(duì)照組wtcasein(-)給予等量生理鹽水隔日皮下注射。15周常規(guī)后收集小鼠尿液、血清液及腎臟組織。檢測小鼠的血尿生化指標(biāo)。剛果紅及高錳酸鉀處理后剛果紅染色觀察小鼠腎臟淀粉樣變及類型;透射電鏡(transmissionelectronmicroscope,tem)、蘇木精-伊紅染色(hematoxylinandeeosinstaining,he)和masson染色觀察腎臟病理改變,westernblot、q-pcr(quantitativepolymerasechainreaction)檢測腎臟損害的炎癥及纖維化基因的mrna和蛋白表達(dá)。第三部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):選用第二部分的wtcasein(+)和cd36-/-casein(+)兩個(gè)組的動(dòng)物模型作為體內(nèi)模型;電鏡觀察小鼠腎臟組織自噬體數(shù)量,westernblot、q-pcr檢測lc3的表達(dá)。免疫熒光檢測腎臟組織的lc3和aa表達(dá)及兩者的共定位關(guān)系。采用westernblot法和免疫組化法檢測ampk,p-ampk的表達(dá)。chip實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了cd36與lc3的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):選取腎臟的常用的兩種細(xì)胞系,即人腎臟系膜細(xì)胞(humanmesangialcells,hmcs)和人近曲小管上皮細(xì)胞(humanproximaltubularcell,hk2)。選用了小干擾rna(smallinterferingrna,sirna)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染建立了cd36sirnahmcs和hk2細(xì)胞的體外模型。進(jìn)一步的用saa1ug/ml處理cd36干擾的兩種不同的細(xì)胞建立體外細(xì)胞aa淀粉樣變模型。在saa處理狀態(tài)下,用自噬檢測試劑盒觀察干擾cd36對(duì)腎臟細(xì)胞自噬的影響。用自噬抑制劑wortman(200nmol/l)處理hk2細(xì)胞和hmcs細(xì)胞后分別分成4組:陰性對(duì)照組(nci+saa),cd36干擾對(duì)照組(cd36i+saa),實(shí)驗(yàn)對(duì)照+自噬抑制劑組(nci+saa+wortman),cd36干擾對(duì)照+自噬抑制劑組(cd36i+saa+wortman)。免疫熒光檢測hk2細(xì)胞內(nèi)aa的沉積狀況。q-pcr檢測hk2細(xì)胞和hmcs細(xì)胞的炎癥和纖維化基因表達(dá)情況。再用ampk抑制劑compoundc(10umol/l)分別處理hk2和hmcs細(xì)胞,將其分為4組:陰性對(duì)照組(nci+saa),cd36干擾對(duì)照組(cd36i+saa),陰性對(duì)照+ampk抑制劑組(nci+saa+compoundc),cd36干擾對(duì)照+ampk抑制劑組(cd36i+saa+compoundc)。用自噬檢測試劑盒檢測自噬,用q-pcr檢測lc3的表達(dá)。以自噬強(qiáng)度和lc3的表達(dá)來評(píng)價(jià)抑制ampk活性對(duì)saa作用下hk2和hmcs的影響。結(jié)果:第一部分:casein皮下注射能上調(diào)wt小鼠血清中血清淀粉樣蛋白a(serumamyloida,saa)的含量。剛果紅染色和電鏡結(jié)果顯示casein能夠誘導(dǎo)wt小鼠腎臟發(fā)生淀粉樣變;免疫組化和westernblot結(jié)果均顯示在casein誘導(dǎo)的淀粉樣變小鼠中cd36的表達(dá)是上調(diào)的。第二部分:剛果紅染色在光鏡和偏振光下觀察到cd36缺失能改善casein誘導(dǎo)的小鼠腎臟淀粉樣變;而高錳酸鉀處理后的剛果紅染色三組均為陰性,說明了在本實(shí)驗(yàn)中casein所誘導(dǎo)的腎臟淀粉樣變是aa型的淀粉樣變。另外我們的透射電鏡結(jié)果也可看到wtcasein(+)組小鼠腎臟有明顯的淀粉樣纖維沉積,而cd36-/-casein(+)組和wtcasein(-)組沒有觀察到。血尿檢測顯示wtcasein(+)組小鼠表現(xiàn)出明顯的腎病綜合征癥狀,即尿量增多,大量蛋白尿,明顯的低蛋白血癥和高脂血癥等,而CD36-/-Casein(+)組小鼠腎功能有改善。HE、MASSON染色、Western blot和Q-PCR結(jié)果均顯示CD36-/-Casein(+)組小鼠腎臟纖維化和炎癥水平較WT Casein(+)組明顯減輕。第三部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn);TEM觀察到CD36-/-Casein(+)組腎小管區(qū)自噬小體較WT Casein(+)增多;CD36-/-Casein(+)組腎臟組織的AA沉積減少而LC3的表達(dá)是上調(diào)的,且AA沉積的部位和LC3表達(dá)的部位能夠重疊。WT Casein(+)組較CD36-/-Casein(+)組小鼠腎臟組織內(nèi)p-AMPK表達(dá)水平明顯降低,且CD36-/-Casein(+)組腎臟組織LC3的表達(dá)較WT Casein(+)增高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):同時(shí)給與SAA處理后,CD36i組較NCi組的自噬明顯增加,AA積聚減少,細(xì)胞炎癥和纖維化指標(biāo)表達(dá)下調(diào)的;自噬抑制劑wortman處理后,NCi組和RNAi組的上述指標(biāo)改變都無明顯差異。另外在AMPK抑制劑Compound C的處理下NCi組和RNAi組的自噬表達(dá)明顯下降,且兩組無顯著差異。結(jié)論:1、Casein能誘導(dǎo)WT小鼠腎臟淀粉樣變的發(fā)生,同時(shí)伴有CD36蛋白的異常高表達(dá)。2、CD36參與了Casein誘導(dǎo)的小鼠腎臟AA淀粉樣病變及組織損傷;CD36的缺失能夠明顯改善腎臟組織淀粉樣纖維的沉積及腎臟損害。3、CD36的缺失可能上調(diào)自噬的產(chǎn)生而清除過多的SAA發(fā)揮保護(hù)腎臟的功能。4、CD36的缺失上調(diào)自噬可能與激活A(yù)MPK上調(diào)LC3的啟動(dòng)子活性有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 宋春華;穆云;馬駿;鄭芳;;血清淀粉樣蛋白A與慢性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號(hào)：1504631