本文關(guān)鍵詞： ADPKD Cordon-bleu 細(xì)胞骨架 初級(jí)纖毛　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:本研究主要驗(yàn)證常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)中是否存在細(xì)胞骨架蛋白成核劑cordon-bleu(Cobl)的表達(dá)異常,并探討Cobl異常對(duì)初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能影響的可能機(jī)制,從而進(jìn)一步了解和豐富初級(jí)纖毛致病假說,為臨床上尋找多囊腎病新靶標(biāo)提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1.常染色體顯性多囊腎病中Cobl表達(dá)差異、初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常的生物學(xué)驗(yàn)證(1)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)與正常人腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)中、多囊腎病動(dòng)物模型pkd1條件敲除小鼠(pkd1~(-/-))與正常對(duì)照小鼠(pkd~(1+/+))腎臟組織中Cobl的表達(dá)差異。(2)運(yùn)用免疫組化方法觀察WT9-12與RCTEC以及pkd1~(-/-)與pkd1~(+/+)腎臟組織中Cobl的定位變化情況。(3)利用激光共聚焦顯微鏡觀察WT9-12與RCTEC中初級(jí)纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。(4)運(yùn)用Real-time PCR方法檢測WT9-12及RCTEC中KIF3A、IFT88的表達(dá)差異。2.細(xì)胞骨架紊亂對(duì)基體(basal body,BB)的遷移定位以及初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究(1)采用免疫熒光方法觀察WT9-12與RCTEC中、pkd1~(-/-)與pkd1~(+/+)腎臟組織中F-actin形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。(2)通過免疫熒光染色方法觀察經(jīng)細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)處理的RCTEC細(xì)胞中F-actin、初級(jí)纖毛的變化情況以及基體的定位。(3)利用掃描電鏡觀察經(jīng)CB處理的RCTEC細(xì)胞形態(tài)及初級(jí)纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。3.Cobl異常對(duì)初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究(1)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl的RCTEC中Cobl、Pacsin 2、KIF3A表達(dá)變化情況。(2)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl表達(dá)的RCTEC中Cobl、Pacsin 2、KIF3A表達(dá)變化情況。(3)利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl及si RNA干擾下調(diào)Cobl的RCTEC中F-actin、基體及初級(jí)纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況。(4)采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl及si RNA干擾下調(diào)Cobl的RCTEC中細(xì)胞增殖變化情況。(5)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl及si RNA干擾下調(diào)Cobl的RCTEC中胞內(nèi)鈣離子濃度變化。(6)通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察質(zhì)粒過表達(dá)Cobl及si RNA干擾下調(diào)Cobl的RCTEC中細(xì)胞遷移變化。結(jié)果:1.常染色體顯性多囊腎病中Cobl表達(dá)差異、初級(jí)纖毛的結(jié)構(gòu)和功能異常的生物學(xué)驗(yàn)證(1)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12中Cobl表達(dá)較RCTEC明顯增多;pkd1~(-/-)小鼠腎臟組織中亦得到相同結(jié)果。(2)通過免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)在RCTEC中Cobl主要定位于細(xì)胞核,而WT9-12的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有Cobl分布;pkd1~(-/-)及pkd1~(+/+)小鼠腎臟組織中Cobl主要于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中,并且在pkd1~(-/-)靠近管腔側(cè)異常增多。(3)利用激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)WT9-12中初級(jí)纖毛數(shù)量較RCTEC少,纖毛長度明顯變短甚至消失。(4)運(yùn)用Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12中KIFA3及IFT88表達(dá)較RCTEC明顯減少;pkd1~(-/-)小鼠腎臟組織中亦得到相同結(jié)果。2.細(xì)胞骨架紊亂對(duì)基體(basal body,BB)的遷移、定位以及初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究(1)免疫熒光發(fā)現(xiàn)WT9-12胞漿中F-actin解聚變短,F-actin小體增多,呈現(xiàn)骨架彌散狀態(tài),而RCTEC胞漿中F-actin聚合形成粗大的F-actin束貫通于細(xì)胞內(nèi);與pkd1~(+/+)小鼠相比,pkd1~(-/-)小鼠腎臟組織中F-actin在腎小管上皮細(xì)胞胞漿靠近管腔側(cè)異常沉積。(2)激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)CB處理RCTEC 0h、1h、2h、6h后,胞漿中F-actin隨處理時(shí)間延長解聚增加,初級(jí)纖毛長度變短甚至消失。(3)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)CB處理后,RCTEC中初級(jí)纖毛隨干擾時(shí)間延長長度變短甚至消失,細(xì)胞縮小。3.Cobl異常對(duì)初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究(1)Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后KIF3A表達(dá)下調(diào);RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl后KIF3A表達(dá)增多。(2)激光共聚焦發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后F-actin聚合增加,初級(jí)纖毛長度變長;RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl后F-actin解聚增加,F-actin含量減少,基體遷移障礙,初級(jí)纖毛長度變短甚至消失。(3)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后抑制細(xì)胞增殖,RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl后促進(jìn)細(xì)胞增殖。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加,RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少。(5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后細(xì)胞遷移增加、方向一致;RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調(diào)Cobl后細(xì)胞遷移能力減弱、方向紊亂。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞及多囊腎病小鼠模型中均存在細(xì)胞骨架蛋白成核劑Cobl表達(dá)上調(diào),以及初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常。Cobl異常可影響F-actin的聚合作用,導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂,從而抑制基體正常遷移至細(xì)胞膜頂端,最終導(dǎo)致初級(jí)纖毛長度變短。上調(diào)Cobl表達(dá)能改善F-actin聚合作用,促進(jìn)基體遷移至細(xì)胞膜頂端,使初級(jí)纖毛長度增加、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、抑制細(xì)胞增殖狀態(tài)、改善細(xì)胞遷移;下調(diào)Cobl表達(dá)抑制F-actin聚合作用,影響基體的正常遷移和定位,使初級(jí)纖毛長度變短、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少、細(xì)胞增殖活躍、遷移紊亂。而前期發(fā)現(xiàn)的Cobl表達(dá)增加的差異性可能是由于PC1缺失無法形成有效的PC1-Cobl復(fù)合物而發(fā)揮一系列調(diào)控功能導(dǎo)致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

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