本文關(guān)鍵詞： 膀胱癌 絲裂原活化蛋白激酶 腹腔鏡膀胱根治性切除術(shù) 增殖 凋亡　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的：探討膀胱癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素及膀胱癌患者癌組織MAPK的表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系,評價(jià)腹腔鏡根治性膀胱切除術(shù)的安全性和的有效性,探討MAPK基因?qū)IU87膀胱癌細(xì)胞株增殖及凋亡的生物學(xué)作用。方法：第一部分：漢族人群膀胱癌高危因素及外周血MAPK表達(dá)水平分析(1) 自2010年1月至2015年1月,在我院泌尿外科收集42例年齡70歲老年膀胱癌患者以及89例年齡小于70歲的膀胱癌患者共131例；在我院體檢中心收集年齡,數(shù)量,性別比例匹配的健康人為健康對照；(2)對入組患者及健康對照者吸煙史,飲酒史,有毒作業(yè)情況等進(jìn)行記錄及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,使用Logistic及單因素對可能的致癌因素進(jìn)行總結(jié)和歸納；(3)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測患者及健康對照者外周血MAPK表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第二部分老年膀胱癌患者腹腔鏡根治性膀胱切除術(shù)的短期及長期預(yù)后觀察(1)將入組的膀胱癌患者按照年齡分為70歲以上及70歲以下兩組。使用腹腔鏡根治性膀胱切除術(shù)對兩組患者進(jìn)行治療；(2)隨訪觀察治療的安全性,手術(shù)成功率,復(fù)發(fā)率,術(shù)后生存情況；(3)術(shù)中留取癌組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色,檢測癌組織及癌旁組織中MAPK表達(dá)水平,對陽性面積百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；第三部分MAPK在膀胱癌中的作用機(jī)制研究(1)構(gòu)建MAPKshRNA,轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞BIU87中；(2)使用流式細(xì)胞儀檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期；(3) western blot檢測細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)水平；(4) transwell小室法檢測膀胱癌細(xì)胞侵襲力；結(jié)果：第一部分：1.對131名膀胱癌患者的性別,年齡,體重,BMI等一般臨床指標(biāo)進(jìn)行記錄與統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與131名健康對照相比,患者的BMI明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在年齡,體重等方面,未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.臨床病史分析主要包括以下幾個(gè)基本病史：性別,家族史,放射線接觸史,吸煙史,飲酒史,有毒物質(zhì)接觸史,高脂飲食史等。我們發(fā)現(xiàn),膀胱癌患者中,高脂飲食,有毒物質(zhì)接觸,及有膀胱癌家族史的患者明顯多于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.對131名膀胱癌患者及健康對照者的外周血MAP K表達(dá)水平進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,病例組中外周血MAPK表達(dá)水平明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.進(jìn)一步在病例組中比較年齡70歲與年齡≤70歲的膀胱癌患者外周血MAPK表達(dá)水平,兩組未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)5.我們對患者進(jìn)行超聲檢查發(fā)現(xiàn),70歲老年患者平均腫瘤體積為(6.9±2.1)cm3,≤70歲老年患者平均腫瘤體積為(6.3±1.9)cm3,兩組相比,差異未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.以年齡、性別是作為配比的條件,對膀胱癌患者組與健康對照組進(jìn)行均衡性檢驗(yàn),結(jié)果顯示年齡組(P=0.2410.05),性別組(P=0.8940.05)在兩組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,年齡、性別均衡,組間具有可比性。7.對病例組與健康對照組進(jìn)行組間相關(guān)性的顯著性檢驗(yàn),判斷與疾病密切相關(guān)的病因因素。由于變量較多,首先采用單因素分析,發(fā)現(xiàn)在我們關(guān)注的納入的可疑因素中,有7項(xiàng)是與研究疾病有關(guān)聯(lián)的。受教育程度和職業(yè)屬于等級分類指標(biāo),采用了秩和檢驗(yàn)。由表1-10,1-11可知：吸煙(P0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8.使用方差齊性檢驗(yàn)對高脂飲食時(shí)間、血糖等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將數(shù)值輸入SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中得出結(jié)果(見表1-11),結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂飲食時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.受教育程度非兩項(xiàng)分類,而是用等級分類,對此采用秩和檢驗(yàn),見表1-12結(jié)果顯示：Z=1.8391.96,P=0.0480.05差別無顯著性,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明受教育程度是膀胱癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一10.進(jìn)一步對職業(yè)性質(zhì)進(jìn)行秩和檢驗(yàn),結(jié)果表明,P0.001,說明兩組間差別具有顯著性,職業(yè)是的膀胱癌相關(guān)因素之一11.經(jīng)顯著性檢驗(yàn)后,在本次入組的患者中最終確認(rèn)5項(xiàng)為膀胱癌發(fā)生的的相關(guān)危險(xiǎn)因素。為進(jìn)一步探討相關(guān)因素與的相關(guān)性,矯正混雜因素。將多種變量納入多因素分析,最終導(dǎo)入非條件Logistic回歸模型。以膀胱癌發(fā)生為自變量,相關(guān)因素為因變量,采用后退法再逐個(gè)進(jìn)行篩選,選入變量的概率標(biāo)準(zhǔn)為0.05,剔除標(biāo)準(zhǔn)為0.05。結(jié)果表明,家族史、吸煙、職業(yè)性質(zhì),有毒物質(zhì)接觸時(shí)間,受教育程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。12.對膀胱癌患者各種影響因素和MAPK表達(dá)水平之間做COX多因素回歸模型分析結(jié)果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在膀胱癌患者中,血清MAPK水平和BMI, TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分：1.在老年組患者的平均年齡為73歲,非老年組平均年齡為58歲(范圍37-69歲；P=0)。老年患者中ASA評分Ⅱ級者數(shù)量眾多(50% vs 20.2% P=0.001),合并癥發(fā)病率明顯高于非老齡組(73.8% vs 21.3%,P=0),特別是高血壓(23.8%vs 9%,P=0.021)和2型糖尿病患者(19% vs 5.6%,P=0.037)明顯多于非老齡組。與非老齡組相比,老齡組患者ASA評分I級者數(shù)量較少(45.2%和78.7%, P=0)。2.手術(shù)過程和90天的術(shù)后并發(fā)癥情況。兩組手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量、輸血量、術(shù)后恢復(fù)時(shí)間、術(shù)后住院時(shí)間及術(shù)后90天并發(fā)癥無顯著性差異。任何患者均未在術(shù)后90天內(nèi)發(fā)生死亡。老年組患者接受輔助化療者較非老年組稍增多,但差異不顯著(P=0.055)。3.兩組的中位隨訪時(shí)間相似。長期預(yù)后的評價(jià)如圖2-1和2-2所示。老年和非老年患者的5年生存率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.274),5年無病生存率(P=0.110)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。老年組有21.3%患者腫瘤復(fù)發(fā),非老年組患者中,復(fù)發(fā)率為33.3%。首次復(fù)發(fā)的時(shí)間的位置之間沒有顯著差異。 多因素分析顯示,腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與0S之間的關(guān)系見表2-5。多因素分析顯示,腫瘤浸潤深度、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與DFS明顯相關(guān)。4.免疫組化染色發(fā)現(xiàn),MAPK在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分：1.為了探討MAPK在BIU87細(xì)胞中的功能,我們構(gòu)建shRNA質(zhì)粒,并最終發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MAPK表達(dá)下調(diào)。我們根據(jù)需要共構(gòu)建了三對人MAPK基因的shRNA序列和一種非特異性拮抗shRNA序列作為陰性對照,并克隆到慢病毒載體中。重組慢病毒并包裝進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞。BIU87細(xì)胞隨后被感染MAPK的RNAi或陰性對照病毒中。使用Western印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了使用RNAi沉默MAPK的結(jié)果如圖2-3A。MAPK-Ri-3被確定為最有效的感染類型,我們選擇他們進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.在轉(zhuǎn)染MAPK-Ri-3病毒的細(xì)胞中,與野生型細(xì)胞(WT)和shRNA拮抗的病毒感染細(xì)胞(NEG)相比,細(xì)胞黏附性降低,因此其生長情況明顯受損。這些數(shù)據(jù)表明,MAPK表達(dá)增加可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖過程,而抑制MAPK后,膀胱癌細(xì)胞增殖受阻。3.與WT(46.2+2.8%)和陰性對照組相比(44.9+1.7%),MAPK表達(dá)受阻可以抑制細(xì)胞增殖,并導(dǎo)致G1期細(xì)胞數(shù)明顯增高(64.9+2.9%)而S期和G2-M期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些數(shù)據(jù)提示MAPK受阻可使細(xì)胞周期阻滯于G1期,這可能與MAPK-Ri-3細(xì)胞增殖受阻有關(guān)。4.在MAPK-Ri-3細(xì)胞中,凋亡率增加到49.6+1.5%,與WT相比(4.3士0.5%)和陰性對照組(5.0±1.0%)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這些數(shù)據(jù)提示MAPK可能在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮著抗凋亡作用。5.MAPK沉默細(xì)胞與對照細(xì)胞相比,其侵襲能力顯著降低。MAPK-Ri-3細(xì)胞的侵襲細(xì)胞百分比為44%。(WT,121±14;陰性對照,118±13; MAPK-Ri-3,44+7)。結(jié)論：吸煙,職業(yè)以及教育背景可能是影響漢族膀胱癌患者發(fā)病的高危因素；MAPK在膀胱癌患者外周血及癌組織中高表達(dá),在老年及非老年患者中,腹腔鏡膀胱癌根治術(shù)對于二者同樣安全有效。MAPK可能通過Bax/Bcl-2調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的增殖及凋亡及細(xì)胞周期,MAPK有望作為膀胱癌治療及診斷的有效靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：1500897