本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌 miR-195 FGF2 NF-κB1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分miR-195在前列腺癌轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用目的：研究miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌及非轉(zhuǎn)移前列腺癌之間表達(dá)的差異,miR-195表達(dá)在轉(zhuǎn)移前列腺癌的診斷以及前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā)中的作用。明確miR-195在前列腺癌轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-mesenchymal transition, EMT)中的作用及機(jī)制,為前列腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。方法：對Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)數(shù)據(jù)庫中獲得的關(guān)于前列腺癌miRNA表達(dá)的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析,比較其在轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移前列腺癌中的表達(dá)差異。分析miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌診斷作用及其與非轉(zhuǎn)移前列腺癌生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。通過原位雜交檢測miR-195在轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移前列腺癌中的表達(dá)。通過Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)明確miR-195對前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用,通過Western bloting檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標(biāo)志物的變化,明確miR-195對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用。通過熒光素酶報(bào)告基因及Western bloting證實(shí)堿性成纖維因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF/FGF2)是miR-195的靶基因。然后通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制FGF2的表達(dá),Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測低表達(dá)FGF2對前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響,Western bloting檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標(biāo)志物的變化。在高表達(dá)miR-195的細(xì)胞中應(yīng)用人重組FGF2后,Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,Western bloting檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標(biāo)志物的變化。最后通過免疫組化檢測轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中FGF2的表達(dá)。結(jié)果：對MSKCC數(shù)據(jù)庫資料的二次分析表明,miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌中的表達(dá)低于非轉(zhuǎn)移前列腺癌。接受者操作特性曲線(Receiver-operating characteristic curve, ROC)分析表明miR-195能夠用于轉(zhuǎn)移前列腺癌的診斷,其曲線下面積(Area under the curve, AUC)為0.705,95%置信區(qū)間為0.507-0.903,P=O.017。原位雜交顯示,miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中的表達(dá)低于非轉(zhuǎn)移前列腺癌組織。在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)miR-195能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力,同時(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化常見標(biāo)識蛋白波形蛋白(vimentin)和N-鈣粘素(N-cadherin)水平降低,E-鈣粘素(E-cadherin)水平升高。報(bào)告基因及Western bloting結(jié)果表明FGF2為miR-195的直接靶基因。通過siRNA抑制FGF2的表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降,波形蛋白和N-鈣粘素水平降低,E-鈣粘素水平升高。而在高表達(dá)miR-195的前列腺癌細(xì)胞中應(yīng)用人重組FGF2處理后,前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯恢復(fù),應(yīng)用人重組FGF2也使波形蛋白和N-鈣粘素水平升高,E-鈣粘素水平降低。免疫組化顯示,FGF2在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中的表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移前列腺癌組織。結(jié)論：miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌患者組織中的表達(dá)低于非轉(zhuǎn)移患者,miR-195能夠用于轉(zhuǎn)移前列腺癌的診斷。體外實(shí)驗(yàn)證明,miR-195能夠通過FGF2抑制前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。第二部分NF-κBl調(diào)控miR-195的表達(dá)目的：明確核因子κB1 (Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells1,NF-κB1)能夠抑制前列腺癌中miR-195的表達(dá)。方法：通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)預(yù)測可能調(diào)控miR-195表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。通過實(shí)時(shí)定量PCR (real time quantitative PCR)篩選抑制miR-195表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。接著通過熒光素酶報(bào)告基因及電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1與miR-195啟動(dòng)子區(qū)的直接結(jié)合。在前列腺癌細(xì)胞中應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制NF-κB1的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR觀察miR-195的表達(dá)。最后通過原位雜交檢測前列腺癌組織中miR-195的表達(dá),免疫組化檢測NF-κB1的表達(dá),并分析兩者之間表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：通過JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測,我們猜想血清效應(yīng)因子(serum response factor, SRF)、早期生長反應(yīng)因子1 (early growth response 1, EGR1)/Sp1轉(zhuǎn)錄因子(Spl transcription factor, SP1)、NF-κB1、KLF5(Kruppel-like factor 5)、叉頭框蛋白P1 (forkhead box P1,FOXP1)、Fli-1原癌基因(Fli-1 proto-oncogene, FLI1)可能調(diào)控miR-195的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR表明,SP1、EGR1、KLF5、FOXP1、FLI1局表達(dá)后miR-195在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)量增高,而高表達(dá)NF-κB1、SRF后PC-3細(xì)胞中miR-195表達(dá)量降低。在起抑制作用的轉(zhuǎn)錄因子中NF-κB1的轉(zhuǎn)錄抑制作用最大。熒光素酶報(bào)告基因和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)前列腺癌中存在NF-κB1與miR-195啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。而在前列腺癌細(xì)胞中通過siRNA抑制NF-κB1表達(dá)后miR-195表達(dá)升高。原位雜交和免疫組化的結(jié)果表明,NF-κB1的表達(dá)與miR-195的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：NF-κB1在前列腺癌中抑制miR-195的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1497705