本文關(guān)鍵詞： 肌層浸潤性膀胱癌 TCGA lncRNA ceRNA miRNA　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一,嚴重危害人類的健康。肌層浸潤性膀胱癌復(fù)發(fā)率及死亡率均較非肌層浸潤性膀胱癌顯著增高,是膀胱癌研究中的重點與熱點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,其自身不編碼蛋白。最初lncRNA被認為在基因組轉(zhuǎn)錄中不起作用,近年來,這些過去被認為是"垃圾序列"的lncRNA越來越引起學(xué)者的重視,其具有重要的生物學(xué)功能。研究表明,對于某些特定的lncRNA,其在正常組織和腫瘤組織中表達水平有明顯差異,而且有些差異和腫瘤的分期及預(yù)后也密切相關(guān)。目前,lncRNA相關(guān)研究已成為腫瘤分子生物學(xué)研究熱點,就泌尿系腫瘤來講,前列腺癌相關(guān)lncRNA研究開始較早,相關(guān)熱點lncRNA包括前列腺癌基因表達標志物1(PCGEM1)、前列腺特異性抗原3(DD3/PCA3)、前列腺癌非編碼RNA1(PRNCR1)等。膀胱癌方面的相關(guān)lncRNA研究尚處于研究進展期。lncRNA和miRNA的相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要調(diào)節(jié)作用。2011 年,競爭性內(nèi)源 RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說在此基礎(chǔ)上被提出,并被越來越多的研究試驗所證實。ceRNA并非是一種新發(fā)現(xiàn)的RNA,而是一種RNA相互作用的調(diào)節(jié)機制,這一機制認為lncRNA、miRNA、mRNA及其它RNAs之間是功能互相調(diào)控的,這些RNA之間正常時處于一種平衡穩(wěn)態(tài),一旦其中某一個或幾個RNA表達出現(xiàn)異常上調(diào)或下調(diào),它們之間的這種平衡穩(wěn)態(tài)就會失衡破壞,就會導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生。lncRNA-miRNA-mRNAceRNA調(diào)控網(wǎng)作為一種新的假說,越來越被研究重視,并已在胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中得以構(gòu)建。目前仍缺乏在全基因組范圍內(nèi),特別是基于高通量檢測與大規(guī)模樣本量的肌層浸潤性膀胱癌相關(guān)的lncRNA和miRNA及的ceRNA的綜合分析。癌癥基因圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)項目組最初由美國國家腫瘤研究所(NCI)和美國國家人類基因組研究所(NHGRI)組成,目前其中已經(jīng)收集了超過30種人類癌癥種類,共約10000例患者樣本和臨床病理信息,并且數(shù)據(jù)全部免費開放,TCGA的最終目標為所有的癌癥基因組構(gòu)建一套相關(guān)的完整"圖譜"。在TCGA數(shù)據(jù)庫中,免費數(shù)據(jù)不僅包括全面詳實的臨床病例資料,還包括患者分子水平測序結(jié)果。目前,已經(jīng)有超過5萬個lncRNA基因在人類基因組中被克隆和鑒定,但僅有其中極少一部分的生物學(xué)功能得到相關(guān)驗證。如何尋找特定腫瘤的功能性lncRNA是相當(dāng)困難的。TCGA數(shù)據(jù)庫相當(dāng)于腫瘤臨床及分子信息的一個蘊藏豐富的寶庫,如何從這一寶庫中甄選出我們希望挖掘的寶藏,就需要嚴謹科學(xué)的工具。這就需要借助生物信息學(xué)工具,及相關(guān)測序統(tǒng)計工具,我們可以從大數(shù)據(jù)中摒棄無關(guān)信息,發(fā)現(xiàn)潛在研究位點。研究方法生物信息學(xué)是計算機科學(xué)、數(shù)學(xué)和生物學(xué)界面的一門多學(xué)科的交叉學(xué)科。它依賴計算機科學(xué)、工程和應(yīng)用數(shù)學(xué)的基礎(chǔ),依賴實驗和衍生數(shù)據(jù)的大量貯存。在本研究中,借助生物信息學(xué)分析技術(shù),通過TCGA數(shù)據(jù)庫提取共341個樣本的3級RNAseq和miRNASeq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分為2個隊列:322例肌層浸潤性膀胱癌和19例正常樣本。腫瘤樣本與正常樣本數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理后,所有未表達的RNA數(shù)據(jù)和miRNA數(shù)據(jù)被濾除。所得數(shù)據(jù)通過DESeq軟件進行處理,得到肌層浸潤性膀胱癌差異表達RNA(differentially expressed RNA,DERNA)和差異表達miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA),進而借助 GENCODE lncRNA數(shù)據(jù)庫(第22版)從中確認差異表達lncRNA。得到肌層浸潤性膀胱癌的DElncRNA和DEmiRNA后,借助miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA-miRNA的相互作用,借助miRTarBase數(shù)據(jù)庫檢索miRNA靶向的mRNAs,進而成功構(gòu)建其lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)。為進一步論證TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出的肌層浸潤性膀胱癌中長鏈非編碼RNA差異表達譜的科學(xué)性,我們篩選研究中預(yù)測的3個表達上調(diào)lncRNA(LINC00162、AATBC、UCA1)和 4 個表達下調(diào) lncRNA(MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1)做進一步的初步試驗驗證。通過 Real-Time PCR檢測32對肌層浸潤性膀胱癌和癌旁正常組織標本中上述7個差異表達lncRNA,并進一步選取目前尚未在膀胱癌中報道的長鏈非編嗎RNA HAND2-AS1做進一步初步功能驗證。通過Real-Time PCR檢測HAND2-AS1在SV-HUC-1和膀胱癌細胞株5637,RT4和J82的表達情況,進一步通過MTT計數(shù)法和劃痕實驗、Transwell,我們驗證了 HAND2-AS1對膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果1.肌層浸潤性膀胱癌中l(wèi)ncRNA和miRNA差異表達譜及相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析研究1.1肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達RNA(differentially expressed RNAs,DERNAs)研究將322個肌層浸潤性膀胱癌腫瘤組織(隊列T)和19個正常組織(隊列N)中的RNA的表達水平進行研究。差異表達基因定義為差異倍數(shù)(log2)絕對值大于1且校正P值小于0.01的基因。通過此標準進行計算機處理,結(jié)果共有472(34.08%)個表達上調(diào)和913(65.92%)個表達下調(diào)的RNA被確認(見附表1)。同時,為了更好地解釋肌層浸潤性膀胱癌發(fā)生的相關(guān)機制,這些差異表達DERNA的功能特性被通過KOBAS2.0進行KEGG分析。27個DERNA(包括21個表達上調(diào)者和6個表達下調(diào)者)被發(fā)現(xiàn)參與細胞周期。1.2肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達lncRNA(differentially expressed lncRNAs,DElnRNAs)根據(jù)差異倍數(shù)(log2)絕對值1.5和校正P值0.01這一判定標準,在肌層浸潤性膀胱癌中,我們發(fā)現(xiàn)有4個lncRNA(LINC00162、AATBC、UCA1和EPR1)的表達顯著上調(diào),有 7 個 lncRNA(MIR2HG、MIR100HG、BRE-AS1、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1和PGM5-AS1,)被證明表達下調(diào)。根據(jù)腫瘤組織樣本病理TNM分期,將樣本分為T3+T4對比T1+T2,N2+N3對比N0+N1,M1對比M0以及有淋巴脈管浸潤對比無淋巴脈管浸潤這些亞組,進而對樣本的lncRNA表達譜進行相關(guān)的比較分析,我們確定了 8個表達上調(diào)lncRNA(LINC00221、UCA1、ZFHX4-AS1、LINC00284、LOC283731、LINC00698、CNTFR-AS1 和 LOC284379)和 4 個表達下調(diào) lncRNA(LINC00390、SSTR5-AS1、HECTD2-AS1 和 LOC400696)和肌層浸潤性膀胱癌的疾病進展分期密切相關(guān)。1.3肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達miRNA(differentially expressed miRNAs,DEmiRNAs)為了構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng),我們還比較了腫瘤組織和正常組織中的miRNA表達譜。確定了 11個差異表達miRNA,包括2個表達上調(diào)和9個表達下調(diào)的miRNA。利用Kaplan-Meier曲線分析法研究肌層浸潤性膀胱癌患者DEmiRNA相關(guān)的總生存率,這11個DEmiRNA中有5個(包括let-7c、mir-100、mir-143、mir-1-2和mir-145)被證明與患者生存率相關(guān)。1.4肌層浸潤性膀胱癌中的相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)的構(gòu)建我們基于以上數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。分析得出有32個DERNA參與了 ceRNA調(diào)控網(wǎng),這32個DERNA中,部分已被報道為癌癥相關(guān)基因,如 CDC25A、CDKN1A、MMP1、MMP13 和 SOX4。同時,我們對調(diào)控網(wǎng)中所包含的DElncRNA和DERNA的表達水平進行了回歸分析,結(jié)果顯示了參與ceRNA的lncRNA和mRNA表達水平之間具有非常一致甚至近乎完美的相互作用關(guān)系。我們還分析了參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)的32個DERNA,分析了由DElncRNA間接調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路,證實有10條KEGG通路中上述DERNA顯著富集,其中包括4條腫瘤相關(guān)通路:腫瘤MicroRNAs、膀胱癌、細胞周期和慢性粒細胞白血病"。2.肌層浸潤性膀胱癌中l(wèi)ncRNA差異表達譜的初步驗證及HAND2-AS1初步功能研究2.1.膀胱癌中相關(guān)差異表達lncRNA的real-time PCR檢測結(jié)果我們從相關(guān)lncRNA差異表達譜中選取了 3個預(yù)測表達上調(diào)和4個預(yù)測表達下調(diào)的lncRNA進行初步驗證。定量Real-Time PCR檢測了共計32對膀胱癌腫瘤組織和癌旁組織標本中7個lncRNA的表達情況。試驗結(jié)果表明:前期研究預(yù)測上調(diào)的lncRNA包括AATBC與UCA1,試驗結(jié)果與前期預(yù)測結(jié)果相符。前期研究預(yù)測下調(diào)的 lncRNA 包括 MIR100HG、MIR143HG、C20orfl66-AS1、HAND2-AS1,試驗結(jié)果與前期預(yù)測結(jié)果均相符。LINC00162在前期TCGA預(yù)測分析中為上調(diào),Real-Time PCR試驗結(jié)果為下調(diào)。7個lncRNAs總體預(yù)測與試驗符合率為85.7%。2.2膀胱癌細胞株中HAND2-AS1基因的Real-Time PCR檢測結(jié)果采用定量Real-Time PCR方法檢測SV-HUC-1,5637,RT4和J82四株細胞系中HAND2-AS1的表達情況。結(jié)果顯示HAND2-AS1確實在膀胱癌細胞株中低表達。2.3 HAND2-AS1對于膀胱癌細胞的增殖、侵襲及遷移的作用。設(shè)計干擾RNA下調(diào)HAND2-AS1在5637細胞株中的表達,結(jié)果顯示干擾后細胞中HAND2-AS1的表達顯著降低,細胞增殖曲線顯示HAND2-AS1基因下調(diào)后,5637細胞的增殖明顯加快。同時,通過劃痕實驗及Transwell法對比分析,試驗初步驗證HAND2-AS1抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲及遷移。結(jié)論1.基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸潤性膀胱癌標本數(shù)據(jù)分析,得出肌層浸潤性膀胱癌的差異表達lncRNA譜及差異表達miRNA譜,借此構(gòu)建相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNAceRNA調(diào)控網(wǎng)。通過相關(guān)通路分析證實,肌層浸潤性膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中多種lncRNA與miRNA參與相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng),在多項信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同發(fā)揮作用。2.基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸潤性膀胱癌標本數(shù)據(jù)分析,得出肌層浸潤性膀胱癌差異表達lncRNA表達譜,通過定量Real-Time PCR法初步驗證AATBC與UCA1在膀胱癌中表達顯著上調(diào),MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1在膀胱癌中表達顯著下調(diào),其初步試驗結(jié)果與前期數(shù)據(jù)分析結(jié)果均一致。除此7個lncRNA外,尚有多個預(yù)測lncRNA需下一步試驗驗證。3.基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸潤性膀胱癌標本數(shù)據(jù)分析及初步組織標本驗證,首次發(fā)現(xiàn)并預(yù)測HAND2-AS1在膀胱癌中的抑癌作用。設(shè)計初步試驗驗證該結(jié)論。初步試驗研究證實HAND2-AS1可以抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲及遷移,但其過表達質(zhì)粒構(gòu)建及下一步相關(guān)動物實驗需進一步進行。
[Abstract]:In recent years , the research of lncRNA - miRNA - mRNAceRNA regulatory network plays an important role in the development of cancer . In this study , we can use bioinformatics tools and relevant sequencing statistics tools . We can use bioinformatics tools and relevant sequencing statistics tools to find potential research sites . Results 1 . The expression levels of lncRNA and miRNA in invasive bladder cancer of muscle layer were investigated . In order to construct an lncRNA - miRNA - mRNA ceRNA regulatory network , we compared the expression profiles of the genes involved in tumor tissue and normal tissue . The results showed that there were 32 DERNA genes involved in cancer - related genes , such as CDC25A , CDKN1A , MMP1 , MMP - 1 - 2 , and SOX4 . The expression of lncRNA - miRNA - mRNAceRNA was determined by quantitative Real - Time PCR .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

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