發(fā)布時間：2018-02-03 21:47

  本文關(guān)鍵詞： 間充質(zhì)干細胞 微囊 缺血再灌注損傷 急性腎損傷 腎臟纖維化 NOX2 氧化應(yīng)激 間質(zhì)干細胞 條件培養(yǎng)基 細胞外微囊 急性腎損傷 Meta分析　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的評估人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells,huWJ-MSC)分泌的微囊(micro-vesicles,MVs)對大鼠缺血再灌注引發(fā)的急慢性損傷的治療作用,并進一步探討其潛在機制。方法從人類臍帶內(nèi)分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞,培養(yǎng)3-6代后無血清饑餓24小時后取其條件培養(yǎng)基(conditional medium,CM),應(yīng)用差速離心法從中分離提純微囊,并蛋白定量。8周齡成年SD大鼠分為假手術(shù)組,實驗組和對照組,并建立單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)模型(保留右腎,左腎缺血1小時后再灌注);實驗組再灌注時立即從尾靜脈注射100μg MVs,對照組注射相同容積的M199細胞培養(yǎng)液。分別在再灌注后24小時,48小時及2周處死動物,取腎臟及血液標(biāo)本進行檢測;腎臟組織切片行HE染色以評估腎臟損傷形態(tài)學(xué)變化并進行評分;應(yīng)用DCFH-DA法檢測腎臟組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)濃度;應(yīng)用檢測腎臟組織內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)濃度來評估脂質(zhì)過氧化程度;應(yīng)用8-OHdG免疫組織化學(xué)染色評估腎臟組織內(nèi)核酸受活性氧損傷情況;應(yīng)用Oxyblot法檢測腎臟組織內(nèi)蛋白質(zhì)受活性氧損傷情況;應(yīng)用TUNNEL染色法評估腎臟組織內(nèi)細胞凋亡情況,同時應(yīng)用Ki67免疫組織化學(xué)染色評估腎臟組織內(nèi)細胞增殖情況;腎臟組織內(nèi)NOX2表達情況應(yīng)用Western-blot和免疫組織化學(xué)染色法進行評估;為評估受損腎臟功能和腎臟纖維化程度,將動物再灌注后第十二天切除右側(cè)腎臟,2周時處死前抽取下腔靜脈血檢測尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)濃度;獲取腎臟組織進行Masson’s三色染色以及α-SMA的表達檢測;體外實驗,培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVECs,以低氧損傷6小時后行MVs或M-199處理48小時,應(yīng)用免疫細胞熒光染色和Western-blot法檢測NOX2的表達。結(jié)果體內(nèi)實驗中,經(jīng)MVs治療后IRI腎臟組織學(xué)損傷評分明顯改善;再灌注后24小時和48小時在蛋白水平,核酸水平及膜脂質(zhì)過氧化水平的氧化應(yīng)激均得到減輕,腎臟組織內(nèi)增殖細胞增多并且凋亡細胞減少,腎臟組織內(nèi)NOX2蛋白表達水平下降并且腎臟組織內(nèi)的活性氧水平降低;在再灌注后兩周,腎臟經(jīng)MVs治療后纖維化水平下降,腎臟功能得到改善;體外實驗中經(jīng)缺氧受損的NRK-52E和HUVEC的NOX2表達增高,經(jīng)MVs處理后NOX2表達降低。結(jié)論單次靜脈應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的MVs可以在缺血再灌注后早期保護腎臟,并且還可以在后期減輕腎臟纖維化以及改善腎臟功能;其機制可能是通過抑制NOX2的表達減輕腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。背景目前在間充質(zhì)干細胞治療各種原因引發(fā)的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的研究中,內(nèi)分泌/旁分泌機制已經(jīng)越來越受到重視;在本研究中,我們對關(guān)于間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)或者間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的細胞外微囊(extracellular-vesicles,Evs)對各種原因引發(fā)的鼠類(大鼠及小鼠)急性腎損傷的治療作用的文獻做了系統(tǒng)性綜述,以肌酐為指標(biāo)做了相關(guān)的Meta分析。方法應(yīng)用我們既定的檢索策略,在Pub Med和Scopus數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)文獻,根據(jù)既定排除標(biāo)準(zhǔn)進行篩選得到相關(guān)文獻;提取文獻中相關(guān)信息,包括基線血清肌酐值、治療前后血清肌酐值、是條件培養(yǎng)基或者微囊治療、治療途徑(delivery rout)、治療時間(therapeutic time point)、肌酐測量時間(measurement time point)、急性腎損傷的模型以及其他相關(guān)的參數(shù)等;對治療前后的肌酐差值行匯總分析(pooled analysis),根據(jù)不同處理行亞組分析(sub-group analysis)和多變量Meta回歸分析(multivariable Meta-regression analysis),同時對于異質(zhì)性的來源和發(fā)表偏倚也做了探討。結(jié)果通過文獻檢索和篩選,總共有13篇文獻納入本研究;匯總分析發(fā)現(xiàn),在鼠類(大鼠或小鼠)的急性腎損傷模型中,經(jīng)條件培養(yǎng)基/微囊治療后血清肌酐值下降(0.93[1.20,0.67],mg/d L);經(jīng)過亞組分析發(fā)現(xiàn),微囊比條件培養(yǎng)基具有更強的治療作用(P=0.05);其他可影響治療治療后肌酐下降值的重要因素包括肌酐測量時間(P=0.0004)以及治療時間點(P0.0001);而其他因素如治療途徑、急性腎損傷的模型、細胞類型等皆不是影響治療效果的重要因素(P0.05);此外,多元Meta回歸分析表明,測量時間點(P=0.041),治療時間點(P=0.03),Ev值或CM(P=0.0003)和細胞類型(P0.0001)是異質(zhì)性的起源。結(jié)論本研究通過Meta分析證實,間充質(zhì)干細胞來源的微囊或者條件培養(yǎng)基對急性腎損傷誘發(fā)的腎功能損害有治療作用;與條件培養(yǎng)基相比較,微囊對急性腎損傷具有更明顯的治療作用;此外,在應(yīng)用條件培養(yǎng)基或微囊治療急性腎損傷時,較早的干預(yù)可能會取得相對較好的治療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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本文編號：1488432