本文關(guān)鍵詞： 間充質(zhì)干細(xì)胞 微囊 缺血再灌注損傷 急性腎損傷 腎臟纖維化 NOX2 氧化應(yīng)激 間質(zhì)干細(xì)胞 條件培養(yǎng)基 細(xì)胞外微囊 急性腎損傷 Meta分析　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的評(píng)估人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells,huWJ-MSC)分泌的微囊(micro-vesicles,MVs)對(duì)大鼠缺血再灌注引發(fā)的急慢性損傷的治療作用,并進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制。方法從人類(lèi)臍帶內(nèi)分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)3-6代后無(wú)血清饑餓24小時(shí)后取其條件培養(yǎng)基(conditional medium,CM),應(yīng)用差速離心法從中分離提純微囊,并蛋白定量。8周齡成年SD大鼠分為假手術(shù)組,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,并建立單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)模型(保留右腎,左腎缺血1小時(shí)后再灌注);實(shí)驗(yàn)組再灌注時(shí)立即從尾靜脈注射100μg MVs,對(duì)照組注射相同容積的M199細(xì)胞培養(yǎng)液。分別在再灌注后24小時(shí),48小時(shí)及2周處死動(dòng)物,取腎臟及血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè);腎臟組織切片行HE染色以評(píng)估腎臟損傷形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)分;應(yīng)用DCFH-DA法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)濃度;應(yīng)用檢測(cè)腎臟組織內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)濃度來(lái)評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化程度;應(yīng)用8-OHdG免疫組織化學(xué)染色評(píng)估腎臟組織內(nèi)核酸受活性氧損傷情況;應(yīng)用Oxyblot法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)蛋白質(zhì)受活性氧損傷情況;應(yīng)用TUNNEL染色法評(píng)估腎臟組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況,同時(shí)應(yīng)用Ki67免疫組織化學(xué)染色評(píng)估腎臟組織內(nèi)細(xì)胞增殖情況;腎臟組織內(nèi)NOX2表達(dá)情況應(yīng)用Western-blot和免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行評(píng)估;為評(píng)估受損腎臟功能和腎臟纖維化程度,將動(dòng)物再灌注后第十二天切除右側(cè)腎臟,2周時(shí)處死前抽取下腔靜脈血檢測(cè)尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)濃度;獲取腎臟組織進(jìn)行Masson’s三色染色以及α-SMA的表達(dá)檢測(cè);體外實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs,以低氧損傷6小時(shí)后行MVs或M-199處理48小時(shí),應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光染色和Western-blot法檢測(cè)NOX2的表達(dá)。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)MVs治療后IRI腎臟組織學(xué)損傷評(píng)分明顯改善;再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)在蛋白水平,核酸水平及膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平的氧化應(yīng)激均得到減輕,腎臟組織內(nèi)增殖細(xì)胞增多并且凋亡細(xì)胞減少,腎臟組織內(nèi)NOX2蛋白表達(dá)水平下降并且腎臟組織內(nèi)的活性氧水平降低;在再灌注后兩周,腎臟經(jīng)MVs治療后纖維化水平下降,腎臟功能得到改善;體外實(shí)驗(yàn)中經(jīng)缺氧受損的NRK-52E和HUVEC的NOX2表達(dá)增高,經(jīng)MVs處理后NOX2表達(dá)降低。結(jié)論單次靜脈應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的MVs可以在缺血再灌注后早期保護(hù)腎臟,并且還可以在后期減輕腎臟纖維化以及改善腎臟功能;其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NOX2的表達(dá)減輕腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。背景目前在間充質(zhì)干細(xì)胞治療各種原因引發(fā)的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的研究中,內(nèi)分泌/旁分泌機(jī)制已經(jīng)越來(lái)越受到重視;在本研究中,我們對(duì)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)或者間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外微囊(extracellular-vesicles,Evs)對(duì)各種原因引發(fā)的鼠類(lèi)(大鼠及小鼠)急性腎損傷的治療作用的文獻(xiàn)做了系統(tǒng)性綜述,以肌酐為指標(biāo)做了相關(guān)的Meta分析。方法應(yīng)用我們既定的檢索策略,在Pub Med和Scopus數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)既定排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到相關(guān)文獻(xiàn);提取文獻(xiàn)中相關(guān)信息,包括基線(xiàn)血清肌酐值、治療前后血清肌酐值、是條件培養(yǎng)基或者微囊治療、治療途徑(delivery rout)、治療時(shí)間(therapeutic time point)、肌酐測(cè)量時(shí)間(measurement time point)、急性腎損傷的模型以及其他相關(guān)的參數(shù)等;對(duì)治療前后的肌酐差值行匯總分析(pooled analysis),根據(jù)不同處理行亞組分析(sub-group analysis)和多變量Meta回歸分析(multivariable Meta-regression analysis),同時(shí)對(duì)于異質(zhì)性的來(lái)源和發(fā)表偏倚也做了探討。結(jié)果通過(guò)文獻(xiàn)檢索和篩選,總共有13篇文獻(xiàn)納入本研究;匯總分析發(fā)現(xiàn),在鼠類(lèi)(大鼠或小鼠)的急性腎損傷模型中,經(jīng)條件培養(yǎng)基/微囊治療后血清肌酐值下降(0.93[1.20,0.67],mg/d L);經(jīng)過(guò)亞組分析發(fā)現(xiàn),微囊比條件培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的治療作用(P=0.05);其他可影響治療治療后肌酐下降值的重要因素包括肌酐測(cè)量時(shí)間(P=0.0004)以及治療時(shí)間點(diǎn)(P0.0001);而其他因素如治療途徑、急性腎損傷的模型、細(xì)胞類(lèi)型等皆不是影響治療效果的重要因素(P0.05);此外,多元Meta回歸分析表明,測(cè)量時(shí)間點(diǎn)(P=0.041),治療時(shí)間點(diǎn)(P=0.03),Ev值或CM(P=0.0003)和細(xì)胞類(lèi)型(P0.0001)是異質(zhì)性的起源。結(jié)論本研究通過(guò)Meta分析證實(shí),間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的微囊或者條件培養(yǎng)基對(duì)急性腎損傷誘發(fā)的腎功能損害有治療作用;與條件培養(yǎng)基相比較,微囊對(duì)急性腎損傷具有更明顯的治療作用;此外,在應(yīng)用條件培養(yǎng)基或微囊治療急性腎損傷時(shí),較早的干預(yù)可能會(huì)取得相對(duì)較好的治療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：1488432