本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌 基因治療 p53AIP1基因　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：p53調(diào)節(jié)的凋亡誘導(dǎo)蛋白1（p53-regulated apoptosis-inducing protein1，p53AIP1）是存在于線粒體上的p53下游通過中斷細(xì)胞膜電勢誘導(dǎo)凋亡的抑癌基因。p53AIP1不僅單獨對腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的促凋亡作用，而且同時聯(lián)合應(yīng)用p53AIP1與p53時，兩者有很好協(xié)同促凋亡作用，并且與細(xì)胞本身的p53狀態(tài)無關(guān)，其促凋亡作用可能強(qiáng)于p53本身，并且對p53有抗性的腫瘤細(xì)胞也有促凋亡作用。前期有報道p53AIP1突變體與散發(fā)前列腺癌關(guān)系密切，大量臨床前期實驗證實p53抑癌基因在前列腺癌基因治療方面作用明顯。然而p53在前列腺癌中的突變率明顯低于其它癌癥，p53AIP1有可能成為前列腺癌治療的潛在新靶點。 研究目的：本實驗我們試圖探討p53AIP1基因?qū)π奂に胤且蕾囆郧傲邢侔┘?xì)胞系PC-3M增殖、凋亡、周期、侵襲和遷移的影響，驗證p53AIP1基因作為前列腺癌治療靶基因的可能，為以p53AIP1基因為靶點治療前列腺癌提供實驗依據(jù)和借鑒。 方法： 1.根據(jù)pDC316真核載體序列，應(yīng)用PCR技術(shù)在p53AIP1兩端引入酶切位點，雙酶切p53AIP1基因與pDC316真核載體，利用同尾酶連接法用T4連接酶將p53AIP1基因與pDC316真核載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pDC316-p53AIP1，并進(jìn)行雙酶切、PCR及測序鑒定。 2.選取雄激素非依賴性的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3M，通過轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將pDC316-p53AIP1轉(zhuǎn)染至PC-3M人前列腺癌細(xì)胞，通過Western blot法觀測蛋白的表達(dá)；CCK-8檢測PC-3M細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡；TranswellTM實驗檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲；TranswellTM實驗檢測腫瘤細(xì)胞的遷移等生物學(xué)行為。 3.腺病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞由于高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和直接局部注射安全性一直是腫瘤基因治療的載體首選，為進(jìn)一步體內(nèi)驗證p53AIP1在前列腺癌的基因治療方面的潛能，我們選取AdMax Adenoviral Vector System，將構(gòu)建的腺病毒穿梭載體pDC316-p53AIP1和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1,3Cre利用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染至腺病毒包裝細(xì)胞HEK293中，通過Cre-loxP重組酶系統(tǒng)發(fā)生定點重組，從而構(gòu)建了攜帶p53AIP1的復(fù)制缺陷性腺病毒載體。大量擴(kuò)增病毒后應(yīng)用氯化銫密度梯度超速離心純化病毒；采用組織培養(yǎng)半量感染法進(jìn)行滴度測定；利用Western Blot技術(shù)驗證腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后的表達(dá)。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pDC316-p53AIP1,通過PCR、雙酶切和測序鑒定，，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDC316-p53AIP1。 2. Western Blot證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞PC-3M中p53AIP1蛋白有表達(dá)；CCK-8結(jié)果顯示p53AIP1的轉(zhuǎn)染能抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3M的增殖(P＜0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測p53AIP1可使得PC-3M細(xì)胞呈現(xiàn)S/G2-M阻滯(P＜0.05)且p53AIP1的轉(zhuǎn)染能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3M的凋亡(P＜0.05)；TranswellTM侵襲和遷移實驗實驗結(jié)果顯示表達(dá)p53AIP1的PC-3M細(xì)胞的侵襲和遷移減少(P＜0.05)。 3.成功構(gòu)建了攜帶p53AIP1復(fù)制缺陷型腺病毒，Western Blot證明轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hella中p53AIP1蛋白有表達(dá)，擴(kuò)增滴度達(dá)3.5×1010pfu/mL。 結(jié)論：綜上所述，通過本實驗研究初步發(fā)現(xiàn)p53AIP1基因治療或許能夠成為雄激素非依賴性的前列腺癌的有效的治療手段并具有很好的應(yīng)用前景。但是在臨床應(yīng)用之前，還需要進(jìn)一步探索和驗證，其中作用機(jī)制和動物實驗等研究是其研究的重點。因此，我們構(gòu)建了攜帶p53AIP1復(fù)制缺陷型腺病毒載體，為接下來的實驗奠定堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background: p53 regulates apoptosis inducing protein 1 (p53-regulated apoptosis-inducing, protein1, p53AIP1) is present in the mitochondrial p53 downstream by tumor suppressor gene.P53AIP1 and cell membrane potential disruption induced apoptosis of tumor cells is not only a separate Pro apoptotic effect is very strong, but at the same time, the combined application of p53AIP1 and p53, both have very good cooperation apoptosis, and it has nothing to do with the p53 cell itself, the apoptosis might be stronger than the p53 itself, and of p53 resistant tumor cells could also induce apoptosis. The mutant p53AIP1 has been reported closely and sporadic prostate cancer, a large number of pre clinical experiments confirmed that p53 tumor suppressor gene significantly role in prostate cancer gene therapy. However, p53 in prostate cancer and the mutation rate was significantly lower than that of other cancers, p53AIP1 has the potential to become a new target for the treatment of prostate cancer.
Objective: in this experiment, we try to explore the effect of p53AIP1 gene on androgen independent prostate cancer cell line PC-3M proliferation, apoptosis, cycle, invasion and migration in vitro, validation of the p53AIP1 gene as a therapeutic target gene of prostate cancer may, with p53AIP1 gene as a target therapy of prostate cancer and provide experimental basis and reference.
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本文編號：1486381