發(fā)布時(shí)間：2018-01-29 16:16

  本文關(guān)鍵詞： 前列腺腫瘤 LNCa P細(xì)胞 人胚腎T細(xì)胞 Notch基因 信號報(bào)告系統(tǒng)　出處：《山東醫(yī)藥》2016年22期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的在前列腺腫瘤細(xì)胞系LNCa P中建立Notch信號報(bào)告系統(tǒng)。方法采用In-Fusion酶系統(tǒng)將巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和Notch蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白CSL的8拷貝串聯(lián)DNA序列克隆入p LVX-ac GFP-N1慢病毒載體,構(gòu)建Notch信號報(bào)告重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(p LVX-8XCSL-ac GFP)。在人胚腎293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p LVX-8XCSL-ac GFP質(zhì)�；�?qū)φ召|(zhì)粒p LVX-ac GFP,6 h后再轉(zhuǎn)染Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的表達(dá)質(zhì)粒p ETP-NICD(過表達(dá)NICD)或?qū)φ召|(zhì)粒p ETP。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá),用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光定量分析。然后將p LVX-8XCSL-ac GFP質(zhì)粒及對照質(zhì)粒包裝成慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系LNCa P,72 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光,用流式細(xì)胞儀分選出GFP熒光強(qiáng)度最強(qiáng)5%及最弱5%的細(xì)胞。提取這兩部分細(xì)胞的RNA,采用qRT-PCR方法檢測細(xì)胞中Notch1、Notch2以及Notch信號通路下游靶基因Hey1的表達(dá)。結(jié)果在轉(zhuǎn)染p LVX-8XCSL-ac GFP的293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染p ETP-NICD的細(xì)胞熒光強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染p ETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞增加了約10倍;而在轉(zhuǎn)染p LVX-ac GFP的293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染p ETP-NICD的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染p ETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強(qiáng)度無明顯差異。根據(jù)p LVX-8XCSL-ac GFP熒光強(qiáng)度分選出的LNCa P細(xì)胞,熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)高于熒光強(qiáng)度弱的細(xì)胞(P均0.05)。結(jié)論在LNCa P細(xì)胞中p LVX-8XCSL-ac GFP可以作為報(bào)告Notch信號水平的有效工具。
[Abstract]:Objective to establish a Notch signal reporting system in prostate cancer cell line LNCa P. methods the cytomegalovirus (CMV) was detected by In-Fusion enzyme system. The 8-copy tandem DNA sequence of DNA binding protein CSL in the nucleus of promoter and Notch protein was cloned into the lentivirus vector of p LVX-ac GFP-N1. Construction of Notch signal reporting Recombinant Lentivirus expression plasmid, p LVX-8XCSL-ac GFP. P LVX-8XCSL-ac GFP plasmid or control plasmid p LVX-ac GFP were transfected into human embryonic kidney 293T cells. Expression plasmid pETP-NICD (overexpression of NICD) in cells transfected with Notch receptor after 6 h. The expression of GFP was observed by fluorescence microscope after transfection of pETP. or control plasmid for 48 h. Fluorescence quantitative analysis was performed by flow cytometry. Then the plasmids of p LVX-8XCSL-ac GFP and control plasmids were packaged into lentivirus transducted prostate cancer cell line LNCa P. After 72 hours, green fluorescence was observed by fluorescence microscope. The cells with the strongest GFP fluorescence intensity of 5% and the weakest 5% were selected by flow cytometry. The RNA of these two parts of cells were extracted. Notch1 in cells was detected by qRT-PCR method. The expression of Notch2 and downstream target gene Hey1 in Notch signaling pathway was detected in 293T cells transfected with p LVX-8XCSL-ac GFP. The fluorescence intensity of the cells transfected with p ETP-NICD was about 10 times higher than that of the control plasmids transfected with p ETP. But in 293T cells transfected with p LVX-ac GFP. There was no significant difference in fluorescence intensity between the cells transfected with p ETP-NICD and the control plasmids transfected with p ETP. LNCa P cells isolated by GFP fluorescence intensity. The cells with high fluorescence intensity were Notch1 and Notch2. The expression of Hey1 was higher than that of cells with weak fluorescence intensity (P < 0.05). Conclusion p LVX-8XCSL-ac GFP can be used as an effective tool to report the level of Notch signal in LNCa P cells.
【作者單位】： 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371507) 上海交通大學(xué)多學(xué)科交叉項(xiàng)目培育項(xiàng)目(醫(yī)工YG2013MS40);上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科技基金(3XJ10016)
【分類號】：R737.25
【正文快照】： Notch信號通路是一條在生物進(jìn)化過程中高度保守的信號通路,其通過相鄰的兩個(gè)細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體和配體相互作用,參與調(diào)控生物體從胚胎到成體組織的眾多發(fā)育過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起重要作用[1,2]。成熟的Notch蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白,主要分為胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)、跨膜結(jié)構(gòu)域

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本文編號：1473814