本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌(prostate cancer) 雄激素依賴性前列腺癌(androgen-dependent prostatecancer ADPC) 去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer CRPC) microRNAs芯片 miR-361-5p 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡　出處：《東南大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前列腺癌的具體病因目前尚不完全清楚。在疾病的早期幾乎均為激素依賴性前列腺癌,去勢治療可緩解病情,幾乎所有患者的病變都將逐漸發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌。去勢抵抗性前列腺癌變得難以控制并且更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,己成為晚期前列腺癌患者主要的死亡原因,目前仍缺乏更為有效的治療方法。在激素依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)變成去勢抵抗性前列腺癌過程中有哪些指標(biāo)發(fā)生了變化,以及這些因素在前列腺癌進(jìn)展中起到了怎樣的作用尚不明確。microRNAs (miRNAs)屬于非編碼RNA,主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。至今己發(fā)現(xiàn)的miRNAs有數(shù)百種,在人類基因組中,miRNAs調(diào)控大約1/3的蛋白編碼基因,控制細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、代謝以及個體的發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥。最近研究發(fā)現(xiàn),超過50%的niRNA基因位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)或脆性位點(diǎn),不但扮演了原癌基因或抑癌基因的角色,還可通過精細(xì)調(diào)節(jié)多條重要信號通路廣泛參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。已有證據(jù)證明miRNA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本研究旨在通過臨床相關(guān)性研究分析出在激素依賴性前列腺癌與去勢抵抗性前列腺癌中表達(dá)有差異性的miRNAs.其中niR-361-5p是我們所感興趣的一重要的miRNA。進(jìn)一步通過前列腺癌細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證niR-361-5p在前列腺癌細(xì)胞中所起到的作用。運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的手段,對miR-361-5p直接作用于STAT6/Bcl-xL途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行丫闡述和驗(yàn)證。第一部分 臨床相關(guān)性研究：miR-361-5p在激素依賴性前列腺癌與去勢抵抗性前列腺癌中表達(dá)的差異性研究目的：隨著人口老齡化及診斷技術(shù)的進(jìn)步,前列腺癌在我國發(fā)病率及檢出率呈明顯上升。前列腺癌初期多數(shù)為雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)最終將轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?CRPC),目前尚無有效的治療手段。分子生物學(xué)方面的研究已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)、診斷、治療該疾病的熱點(diǎn),miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá),控制細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。通過miRNAs芯片檢測發(fā)現(xiàn)在早期ADPC與晚期CRPC組織中有差異性表達(dá)的miRNA,并進(jìn)一步通過qRT-PCR和ISH實(shí)驗(yàn)檢測驗(yàn)證。研究方法：新鮮手術(shù)標(biāo)本在新鮮冰凍切片指示下收集早期雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)與晚期去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)組織在液氮中保存,取3例ADPC與3例CRPC組織行niRNAs芯片檢測；繼續(xù)通過qRT-PCR和ISH實(shí)驗(yàn)檢測驗(yàn)證在早期ADPC與晚期CRPC組織中miR-361-5p的表達(dá)差異。研究結(jié)果：microRNAs芯片檢測發(fā)現(xiàn)一些miRNA在早期ADPC與晚期CRPC組織中表達(dá)異常,其中niR-361-5p在后續(xù)的qRT-PCR和ISH實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證均表明在CRPC中miR-361-5p的表達(dá)較ADPC中顯著下降(P0.05)。研究結(jié)論：在CRPC中miR-361-5p的表達(dá)較ADPC中顯著下降,提示miR-361-5p隨著前列腺癌的進(jìn)展而降低,可能是一潛在的重要的抑癌基因。第二部分miR-361-5p在前列腺癌中的功能性研究：miR-361-5p對前列腺癌細(xì)胞周期、凋亡、增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)成瘤的影響研究目的：文獻(xiàn)報導(dǎo)在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能出現(xiàn)miR-361-5p的缺失,我們也推測miR-361-5p的表達(dá)降低可能參與前列腺癌細(xì)胞由激素依賴向去勢抵抗性的轉(zhuǎn)化,但miR-361-5p在前列腺癌中的具體作用尚無系統(tǒng)的相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證報道。通過體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),探討miR-361-5p對去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞DU145與PC3的細(xì)胞周期變化、細(xì)胞凋亡比例、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,以及裸鼠活體皮下成瘤能力的影響。研究方法：體外功能實(shí)驗(yàn)在去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞DU145與PC3中轉(zhuǎn)染niR-361-5p mimics與NC后通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit, CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性變化；低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染1niR-361-5p mimics與NC后細(xì)胞形成克隆的能力；轉(zhuǎn)染miR-361-5p mimics與NC后的前列腺癌細(xì)胞采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況；轉(zhuǎn)染miR-361-5p mimics與NC后的前列腺癌細(xì)胞采用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞穿透Transwell小室的能力變化；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-361-5p對前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)形成腫瘤能力的影響,移植瘤標(biāo)本采用免疫組化法檢測Ki-67、CD34的表達(dá)變化,進(jìn)一步佐證miR-361-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖及微血管形成的影響。研究結(jié)果：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在DU145和PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染niR-361-5p mimics與NC組相比miR-361-5p能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖(P0.05)。在低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染miR-361-5p mimics與NC組相比miR-361-5p可以顯著抑制細(xì)胞形成克隆的數(shù)目和大小(P0.01)。采用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染niR-361-5p mimics與NC組相比]miR-361-5p能夠致使前列腺癌細(xì)胞周期被阻滯在G1期的比例明顯升高(P0.01),并顯著增加前列腺癌細(xì)胞凋亡的比例(P0.01)。在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-361-5p mimics與NC組相比轉(zhuǎn)染miR-361-5p后可致通過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.01)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-361-5p的細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤的大小明顯小于對照組(P0.01),移植瘤病理切片免疫組化提示Ki-67、CD34的表達(dá)均降低。研究結(jié)論：miR-361-5p能夠抑制CRPC細(xì)胞DU145和PC3的增殖、遷移能力,阻滯細(xì)胞在G1期,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抑癌基因的作用。第三部分分子機(jī)制研究：miR-361-5p直接作用于STAT6/Bcl-xL途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡研究目的：通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測出信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-6(Signal transducer and activator of transcription-6, STAT6)可能是niR-361-5p在前列腺癌中的潛在靶基因。我們試圖通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證STAT6在前列腺癌中的作用；以及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-361-5p能夠與STAT6的3’-UTR直接結(jié)合抑制STAT6的表達(dá)；B細(xì)胞淋巴瘤放大因子(B-cell lymphoma-extra large, Bcl-xL)是Bcl-2家族的一重要成員,是重要的促細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡因素,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)在前列腺癌中STAT6能夠與Bcl-xL的啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)Bcl-xL的表達(dá)。研究方法：采用生物信息學(xué)檢索和預(yù)測；依據(jù)所檢索和預(yù)測到的可能結(jié)合的種子序列區(qū)域構(gòu)建雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒(STAT6 psiCHECK-2 reporter)載體,熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)及蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blotting)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在前列腺癌中miR-361-5p對STAT6的作用；依據(jù)所檢索和預(yù)測到的STAT6與Bcl-xL啟動子區(qū)域結(jié)合的序列構(gòu)建熒光素酶報告基因質(zhì)粒(Bcl-xL pGL3-basic reporter)載體,熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)及Western Blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在前列腺癌中STAT6對Bcl-xL表達(dá)的影響；采用裸鼠皮下成瘤模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證niR-361-5p對體內(nèi)成瘤的影響,所形成的移植瘤采用免疫組化法進(jìn)一步檢測STAT6、Bcl-xL的表達(dá)情況。研究結(jié)果：通過生物信息學(xué)檢索和預(yù)測、熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)以及Western Blotting實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明：在前列腺癌中miR-361-5p可直接與STAT6的3’端非翻譯區(qū)域(3'-untranslated regions,3'-UTR)結(jié)合,miR-361-5p皂夠?qū)TAT6起直接靶向抑制作用。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)在前列腺癌中STAT6起到重要促癌作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)、qRT-PCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在前列腺癌中STAT6能夠促進(jìn)Bcl-xL的表達(dá)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-361-5p的細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤的大小明顯小于對照組(P0.05),移植瘤病理切片免疫組化提示STAT6、Bcl-xL的表達(dá)降低。研究結(jié)論：STAT6是miR-361-5p的直接靶基因,STAT6在前列腺癌中起促癌作用,miR-361-5p可通過抑制STAT6降低Bcl-xL的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

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1 劉大闖;miR-361-5p對前列腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機(jī)制的研究[D];東南大學(xué);2015年

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本文編號：1466100