本文關(guān)鍵詞： 黃芪多糖 骨骼肌肌管 骨骼肌成肌細(xì)胞 萎縮 凋亡 活性氧簇　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：營(yíng)養(yǎng)不良是慢性腎衰竭(Chronic renal failure, CRF)常見的重要并發(fā)癥,亦是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)和CRF患者死亡率升高的主要原因之一。在我國(guó),約20%-50%的CRF患者可以發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良。CRF營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,并且與免疫功能低下、感染、貧血、心血管事件等各種并發(fā)癥密切相關(guān),甚至導(dǎo)致多器官衰竭,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前臨床治療主要使用的類胰島素生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor1, IGF-1)注射和復(fù)方α-酮酸(開同),因其價(jià)格昂貴使其應(yīng)用受到局限。因此,經(jīng)濟(jì)有效地預(yù)防、治療CRF營(yíng)養(yǎng)不良已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中極為重要的問題。 CRF營(yíng)養(yǎng)不良受多因素介導(dǎo),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入減少、代謝及內(nèi)分泌紊亂、透析過程中丟失蛋白質(zhì)、貧血、炎癥等各種原因均可導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良。骨骼肌萎縮導(dǎo)致的骨骼肌質(zhì)量及體重下降是其重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)代謝失衡是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的根本原因,包括各種原因引起的合成代謝減少和分解代謝增加,其分子機(jī)制十分復(fù)雜。蛋白質(zhì)分解代謝主要由四條途徑介導(dǎo)：溶酶體途徑(Lysosomal pathway),鈣依賴性途徑(Ca2+-dependent pathway),半胱天冬氨酸蛋白水解酶途徑(Caspase-dependent pathway)和泛素蛋白酶體依賴性途徑(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)。而與之相對(duì)的IGF-1可以通過上調(diào)蛋白激酶B/雷帕霉素把蛋白酶(Akt/mTOR)信號(hào)通路,磷酸化下游蛋白激酶入核,激活核內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)相關(guān)mRNA翻譯過程從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成。近年來研究證實(shí)在CRF營(yíng)養(yǎng)不良過程中,不僅存在著蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng),其合成代謝亦嚴(yán)重受到抑制,骨骼肌Akt, mTOR表達(dá)水平均明顯降低。因此,探尋通過上調(diào)Akt/mTOR信號(hào)通路治療CRF營(yíng)養(yǎng)不良的新方法,尋找其作用更特異,有效的調(diào)控因子或環(huán)節(jié),具有重要的臨床意義。 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Muscle satellite cell, MSC)是位于肌纖維膜與基底膜之間的一種單核多能干細(xì)胞,由于其在激活后能增殖分化成新的肌纖維,廣泛參與骨骼肌組織的修復(fù)與再生,成為近年來研究的熱點(diǎn)。靜息狀態(tài)下的MSC細(xì)胞器較少,染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞變現(xiàn)為靜止和缺乏轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)機(jī)體經(jīng)受骨骼肌創(chuàng)傷等刺激后,靜息態(tài)肌MSC的胞質(zhì)發(fā)生擴(kuò)張、激活,形成成肌細(xì)胞,并進(jìn)一步分化、融合形成肌管,進(jìn)而參與骨骼肌的修復(fù)。然而在CRF營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境下,此過程受到多方面的影響,包括尿毒癥毒素,代謝性酸中毒,微炎癥狀態(tài),營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等能抑制MSC的激活、生長(zhǎng)、分化過程。其中氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)反應(yīng)普遍存在于上述影響因素中,是引起MSC損傷的重要一環(huán)。CRF營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境下產(chǎn)生過量的活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS),能與MSC和成肌細(xì)胞生物膜的上的磷脂、酶和膜受體發(fā)生反應(yīng),氧化機(jī)體的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì),損害細(xì)胞生物膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核及各種代謝酶的功能,最終導(dǎo)致MSC及成肌細(xì)胞的損傷及凋亡,失去修復(fù)能力。由此可推斷,清除機(jī)體內(nèi)過量的ROS,降低OS反應(yīng)水平,促進(jìn)MSC的激活分、化過程,對(duì)骨骼肌萎縮延緩與修復(fù)具有重要意義。 CRF營(yíng)養(yǎng)不良所致的骨骼肌萎縮,屬于中醫(yī)的“虛勞”、“痿癥”的范疇。脾腎氣虛是其發(fā)病基礎(chǔ)。脾為后天之本,氣血生化之源。因此“補(bǔ)脾益氣”法在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)CRF營(yíng)養(yǎng)不良所致的骨骼肌萎縮的認(rèn)識(shí)與治療中有重要的地位。藥用黃芪是豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch) Bge)和蒙古黃芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus (Bge) Hsiao)的根,味甘,性微溫,為常用中藥材之一。我國(guó)藥典記載其有補(bǔ)氣健脾,益衛(wèi)固表,利尿消腫,托毒生肌之功效,亦是歷代醫(yī)家在治療“虛勞”、“痿癥”時(shí)常用、重用之品。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)為中藥黃芪的水提多糖成分,是黃芪的主要生物活性成分�，F(xiàn)代體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明,APS對(duì)機(jī)體免疫功能紊亂、炎癥狀態(tài)、OS等具有調(diào)控改善作用,而這些狀態(tài)與骨骼肌萎縮在病因和機(jī)制上密切聯(lián)系,一些研究進(jìn)一步證實(shí)了APS能夠上調(diào)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的骨骼肌細(xì)胞Akt表達(dá),維持骨骼肌合成代謝水平。我們基于此猜想APS能夠通過通過促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成,拮抗MSC氧化損傷,從而預(yù)防和改善骨骼肌萎縮狀態(tài)。因此,本課題通過體外實(shí)驗(yàn),觀察APS對(duì)骨骼肌萎縮的改善作用,同時(shí)探索相關(guān)分子機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體如下： 第1章APS對(duì)C2C12肌管萎縮改善作用 目的：觀察APS對(duì)地塞米松(Dexamethasone, DEX)誘導(dǎo)C2C12骨骼肌肌管萎縮的保護(hù)作用,并探索其機(jī)制。 方法：首先用含低濃度血清培養(yǎng)高密度骨骼肌C2C12成肌細(xì)胞,使其分化成C2C12肌管。之后用用含有1μM Dex的培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌C2C12肌管建立骨骼肌萎縮模型,并分為3組：Dex模型對(duì)照組,Dex+APS組,Dex+APS+LY組,另設(shè)正常對(duì)照組和APS對(duì)照組。Dex+APS組與APS對(duì)照組APS實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定均為0.2mg/mL。 Dex+APS+LY組另加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)阻斷劑LY294002(LY),濃度10μM。每組均孵育24h之后固定細(xì)胞,用伊紅-蘇木素(HE)法對(duì)各組進(jìn)行染色,用200倍光鏡對(duì)各組進(jìn)行拍照,用Image Pro-Plus軟件計(jì)算各組肌管的平均橫徑；用Western blot法檢測(cè)各組磷酸化的Akt、mTOR、核糖體蛋白S6激酶(P70s6k)、核糖體蛋白S6(rpS6)、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子3a (Fox03a)的表達(dá)含量。內(nèi)參照采用GAPDH。 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比,Dex模型組肌管平均橫徑顯著減小,APS干預(yù)可以改善橫徑減小程度,LY294002能夠明顯拮抗這種改善作用,減小C2C12肌管橫徑,以上組間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而APS對(duì)照組與正常對(duì)照組之間肌管橫徑比較無差異；磷酸化的Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6在正常組中均有明顯或零散表達(dá),Dex模型組中磷酸化Akt、mTOR、 P70s6k、rpS6的表達(dá)量明顯減少,FoxO1與Fox03a的表達(dá)含量顯著增加,而APS能夠恢復(fù)模型組以上信號(hào)因子的異常表達(dá),LY294002能拮抗除FoxO3a以外所有APS對(duì)信號(hào)因子的恢復(fù)作用,以上組間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而單加APS組與正常對(duì)照組之間相比,Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6的表達(dá)量均無差異。 結(jié)論：骨骼肌萎縮狀態(tài)下肌管橫徑減小,Akt/mTOR信號(hào)通路明顯受到抑制。APS可有效調(diào)控恢復(fù)Akt/mTOR信號(hào),增大肌管橫徑,從而改善骨骼肌萎縮狀態(tài)。 第2章APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的增殖作用 目的：觀察APS和Dex對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響。 方法：觀察濃度梯度APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成6組,分別用含不同濃度APS的培養(yǎng)基培養(yǎng)(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL),另設(shè)空白對(duì)照組,分別孵育24h；觀察時(shí)間梯度APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成4組,用含0.2mg/mL APS的培養(yǎng)基分別孵育8h、12h、24h、48h,每組均另設(shè)一組空白對(duì)照;觀察Dex對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成5組,分別用含不同濃度Dex的培養(yǎng)基培養(yǎng)(0.1μm、1μm、10μm、100μm、1000μM),另設(shè)空白對(duì)照組,分別孵育24h；觀察APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞活性損傷的改善作用：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成空白對(duì)照組、過氧化氫組、APS組,過氧化氫組實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為200μM,APS組在此基礎(chǔ)用0.2mg/mL藥物干預(yù),按8h、12h、24h孵育時(shí)間重復(fù)三次。用MTT法檢測(cè)以上各組C2C12成肌細(xì)胞的增殖率及活性。 結(jié)果：濃度梯度APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：與正常對(duì)照組相比,0.05mg/mL～0.5mg/mL的APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞具有顯著的增殖效果,其中0.05mg/mL～0.2mg/mL段呈濃度-效應(yīng)關(guān)系,2mg/mL的APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖具有抑制作用,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；時(shí)間梯度APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：與正常對(duì)照組相比,12h-48h內(nèi)APSC2C12成肌細(xì)胞具有顯著的增殖效果,其中12h～24h段呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); Dex對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖率的影響：與正常組相比,100μM及1000μM Dex能顯著抑制C2C12成肌細(xì)胞增殖,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而0.1μM、1μM、10μM Dex對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖均無影響；APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞活性損傷的改善作用：與正常組相比,過氧化氫干預(yù)12h和24h后能降低C2C12成肌細(xì)胞活性,APS對(duì)過氧化氫的干預(yù)效果有抑制作用,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：APS在一定的濃度和時(shí)間內(nèi)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,并能改善過氧化氫誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞活性損傷,Dex濃度小于10μM時(shí)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖無影響。 第3章APS對(duì)C2C12成肌細(xì)胞抗凋亡及抗氧化作用 目的：觀察APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡及OS的改善作用,并探索其機(jī)制。 方法：觀察APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡的改善作用：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成4組,用含200μM和500μM過氧化氫的培養(yǎng)基培養(yǎng),并分別用0.2mg/mL APS進(jìn)行干預(yù)作為藥物對(duì)照組,另設(shè)兩組作為空白對(duì)照組,孵育24h后用PI/Annexin V染色法檢測(cè)各組C2C12成肌細(xì)胞凋亡狀況；探索APS抗凋亡的分子機(jī)制：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成過氧化氫模型組與APS干預(yù)組,過氧化氫模型組用量設(shè)定為200μM, APS干預(yù)組用量設(shè)定0.2mg/mL,并另設(shè)正常對(duì)照組和APS對(duì)照組,孵育24h后用Western blot法對(duì)各組Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)；觀察APS對(duì)ROS的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞分成4組,用含200μM和500μM過氧化氫的培養(yǎng)基培養(yǎng),并分別用0.2mg/mL和0.5mg/mL APS進(jìn)行干預(yù)作為藥物對(duì)照組,另設(shè)空白對(duì)照組,孵育30min后用DCFH-DA探針法檢測(cè)ROS濃度。 結(jié)果：APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡的改善作用：與正常對(duì)照組相比,200μM和500μM的過氧化氫組C2C12成肌細(xì)胞的凋亡率均明顯上升,與模型組相比,經(jīng)APS干預(yù)后能顯著減少凋亡,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；探索APS抗凋亡的分子機(jī)制：與正常對(duì)照組相比,在過氧化氫模型組中,Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表達(dá)顯著增加,Bcl-2表達(dá)減少。相對(duì)于模型組,APS能夠顯著下調(diào)Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表達(dá),恢復(fù)Bcl-2表達(dá)量,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); APS對(duì)ROS的影響：與正常對(duì)照組相比,200gM和500μM過氧化氫組中ROS濃度顯著上升,0.2mg/mL和0.5mg/mL APS均能有效降低ROS濃度,以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：APS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡及OS均具有改善作用,其機(jī)制可能是能通過調(diào)節(jié)caspase8/caspase3以及Bcl-2/Bax兩條凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692.5

【參考文獻(xiàn)】

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