本文關鍵詞： 黃芪多糖 骨骼肌肌管 骨骼肌成肌細胞 萎縮 凋亡 活性氧簇　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：營養(yǎng)不良是慢性腎衰竭(Chronic renal failure, CRF)常見的重要并發(fā)癥,亦是導致終末期腎病(ESRD)和CRF患者死亡率升高的主要原因之一。在我國,約20%-50%的CRF患者可以發(fā)生營養(yǎng)不良。CRF營養(yǎng)不良發(fā)病機制復雜,并且與免疫功能低下、感染、貧血、心血管事件等各種并發(fā)癥密切相關,甚至導致多器官衰竭,嚴重影響患者的生存質量。目前臨床治療主要使用的類胰島素生長因子1(Insulin-like growth factor1, IGF-1)注射和復方α-酮酸(開同),因其價格昂貴使其應用受到局限。因此,經濟有效地預防、治療CRF營養(yǎng)不良已成為醫(yī)學領域中極為重要的問題。 CRF營養(yǎng)不良受多因素介導,營養(yǎng)物質攝入減少、代謝及內分泌紊亂、透析過程中丟失蛋白質、貧血、炎癥等各種原因均可導致營養(yǎng)不良。骨骼肌萎縮導致的骨骼肌質量及體重下降是其重要指標。蛋白質代謝失衡是導致骨骼肌萎縮的根本原因,包括各種原因引起的合成代謝減少和分解代謝增加,其分子機制十分復雜。蛋白質分解代謝主要由四條途徑介導：溶酶體途徑(Lysosomal pathway),鈣依賴性途徑(Ca2+-dependent pathway),半胱天冬氨酸蛋白水解酶途徑(Caspase-dependent pathway)和泛素蛋白酶體依賴性途徑(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)。而與之相對的IGF-1可以通過上調蛋白激酶B/雷帕霉素把蛋白酶(Akt/mTOR)信號通路,磷酸化下游蛋白激酶入核,激活核內多種轉錄因子,促進相關mRNA翻譯過程從而增強蛋白質合成。近年來研究證實在CRF營養(yǎng)不良過程中,不僅存在著蛋白質分解代謝增強,其合成代謝亦嚴重受到抑制,骨骼肌Akt, mTOR表達水平均明顯降低。因此,探尋通過上調Akt/mTOR信號通路治療CRF營養(yǎng)不良的新方法,尋找其作用更特異,有效的調控因子或環(huán)節(jié),具有重要的臨床意義。 骨骼肌衛(wèi)星細胞(Muscle satellite cell, MSC)是位于肌纖維膜與基底膜之間的一種單核多能干細胞,由于其在激活后能增殖分化成新的肌纖維,廣泛參與骨骼肌組織的修復與再生,成為近年來研究的熱點。靜息狀態(tài)下的MSC細胞器較少,染色質濃縮,細胞變現(xiàn)為靜止和缺乏轉錄活性。當機體經受骨骼肌創(chuàng)傷等刺激后,靜息態(tài)肌MSC的胞質發(fā)生擴張、激活,形成成肌細胞,并進一步分化、融合形成肌管,進而參與骨骼肌的修復。然而在CRF營養(yǎng)的環(huán)境下,此過程受到多方面的影響,包括尿毒癥毒素,代謝性酸中毒,微炎癥狀態(tài),營養(yǎng)元素缺乏等能抑制MSC的激活、生長、分化過程。其中氧化應激(Oxidative Stress,OS)反應普遍存在于上述影響因素中,是引起MSC損傷的重要一環(huán)。CRF營養(yǎng)的環(huán)境下產生過量的活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS),能與MSC和成肌細胞生物膜的上的磷脂、酶和膜受體發(fā)生反應,氧化機體的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質,損害細胞生物膜、細胞器、細胞核及各種代謝酶的功能,最終導致MSC及成肌細胞的損傷及凋亡,失去修復能力。由此可推斷,清除機體內過量的ROS,降低OS反應水平,促進MSC的激活分、化過程,對骨骼肌萎縮延緩與修復具有重要意義。 CRF營養(yǎng)不良所致的骨骼肌萎縮,屬于中醫(yī)的“虛勞”、“痿癥”的范疇。脾腎氣虛是其發(fā)病基礎。脾為后天之本,氣血生化之源。因此“補脾益氣”法在傳統(tǒng)醫(yī)學對CRF營養(yǎng)不良所致的骨骼肌萎縮的認識與治療中有重要的地位。藥用黃芪是豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch) Bge)和蒙古黃芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus (Bge) Hsiao)的根,味甘,性微溫,為常用中藥材之一。我國藥典記載其有補氣健脾,益衛(wèi)固表,利尿消腫,托毒生肌之功效,亦是歷代醫(yī)家在治療“虛勞”、“痿癥”時常用、重用之品。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)為中藥黃芪的水提多糖成分,是黃芪的主要生物活性成分。現(xiàn)代體內外實驗及臨床研究表明,APS對機體免疫功能紊亂、炎癥狀態(tài)、OS等具有調控改善作用,而這些狀態(tài)與骨骼肌萎縮在病因和機制上密切聯(lián)系,一些研究進一步證實了APS能夠上調胰島素抵抗狀態(tài)下的骨骼肌細胞Akt表達,維持骨骼肌合成代謝水平。我們基于此猜想APS能夠通過通過促進骨骼肌蛋白質合成,拮抗MSC氧化損傷,從而預防和改善骨骼肌萎縮狀態(tài)。因此,本課題通過體外實驗,觀察APS對骨骼肌萎縮的改善作用,同時探索相關分子機制,為其臨床應用提供實驗依據(jù)。具體如下： 第1章APS對C2C12肌管萎縮改善作用 目的：觀察APS對地塞米松(Dexamethasone, DEX)誘導C2C12骨骼肌肌管萎縮的保護作用,并探索其機制。 方法：首先用含低濃度血清培養(yǎng)高密度骨骼肌C2C12成肌細胞,使其分化成C2C12肌管。之后用用含有1μM Dex的培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌C2C12肌管建立骨骼肌萎縮模型,并分為3組：Dex模型對照組,Dex+APS組,Dex+APS+LY組,另設正常對照組和APS對照組。Dex+APS組與APS對照組APS實驗用量設定均為0.2mg/mL。 Dex+APS+LY組另加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)阻斷劑LY294002(LY),濃度10μM。每組均孵育24h之后固定細胞,用伊紅-蘇木素(HE)法對各組進行染色,用200倍光鏡對各組進行拍照,用Image Pro-Plus軟件計算各組肌管的平均橫徑；用Western blot法檢測各組磷酸化的Akt、mTOR、核糖體蛋白S6激酶(P70s6k)、核糖體蛋白S6(rpS6)、叉形頭轉錄因子1(FoxO1)、叉形頭轉錄因子3a (Fox03a)的表達含量。內參照采用GAPDH。 結果：與正常對照組相比,Dex模型組肌管平均橫徑顯著減小,APS干預可以改善橫徑減小程度,LY294002能夠明顯拮抗這種改善作用,減小C2C12肌管橫徑,以上組間的比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而APS對照組與正常對照組之間肌管橫徑比較無差異；磷酸化的Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6在正常組中均有明顯或零散表達,Dex模型組中磷酸化Akt、mTOR、 P70s6k、rpS6的表達量明顯減少,FoxO1與Fox03a的表達含量顯著增加,而APS能夠恢復模型組以上信號因子的異常表達,LY294002能拮抗除FoxO3a以外所有APS對信號因子的恢復作用,以上組間的比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而單加APS組與正常對照組之間相比,Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6的表達量均無差異。 結論：骨骼肌萎縮狀態(tài)下肌管橫徑減小,Akt/mTOR信號通路明顯受到抑制。APS可有效調控恢復Akt/mTOR信號,增大肌管橫徑,從而改善骨骼肌萎縮狀態(tài)。 第2章APS對C2C12成肌細胞的增殖作用 目的：觀察APS和Dex對C2C12成肌細胞增殖率的影響。 方法：觀察濃度梯度APS對C2C12成肌細胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成6組,分別用含不同濃度APS的培養(yǎng)基培養(yǎng)(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL),另設空白對照組,分別孵育24h；觀察時間梯度APS對C2C12成肌細胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成4組,用含0.2mg/mL APS的培養(yǎng)基分別孵育8h、12h、24h、48h,每組均另設一組空白對照;觀察Dex對C2C12成肌細胞增殖率的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成5組,分別用含不同濃度Dex的培養(yǎng)基培養(yǎng)(0.1μm、1μm、10μm、100μm、1000μM),另設空白對照組,分別孵育24h；觀察APS對過氧化氫誘導C2C12成肌細胞活性損傷的改善作用：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成空白對照組、過氧化氫組、APS組,過氧化氫組實驗用量設定為200μM,APS組在此基礎用0.2mg/mL藥物干預,按8h、12h、24h孵育時間重復三次。用MTT法檢測以上各組C2C12成肌細胞的增殖率及活性。 結果：濃度梯度APS對C2C12成肌細胞增殖率的影響：與正常對照組相比,0.05mg/mL～0.5mg/mL的APS對C2C12成肌細胞具有顯著的增殖效果,其中0.05mg/mL～0.2mg/mL段呈濃度-效應關系,2mg/mL的APS對C2C12成肌細胞增殖具有抑制作用,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；時間梯度APS對C2C12成肌細胞增殖率的影響：與正常對照組相比,12h-48h內APSC2C12成肌細胞具有顯著的增殖效果,其中12h～24h段呈時間-效應關系,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05); Dex對C2C12成肌細胞增殖率的影響：與正常組相比,100μM及1000μM Dex能顯著抑制C2C12成肌細胞增殖,比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),而0.1μM、1μM、10μM Dex對C2C12成肌細胞增殖均無影響；APS對過氧化氫誘導C2C12成肌細胞活性損傷的改善作用：與正常組相比,過氧化氫干預12h和24h后能降低C2C12成肌細胞活性,APS對過氧化氫的干預效果有抑制作用,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論：APS在一定的濃度和時間內對C2C12成肌細胞的增殖有促進作用,并能改善過氧化氫誘導的C2C12成肌細胞活性損傷,Dex濃度小于10μM時對C2C12成肌細胞增殖無影響。 第3章APS對C2C12成肌細胞抗凋亡及抗氧化作用 目的：觀察APS對過氧化氫誘導的C2C12成肌細胞凋亡及OS的改善作用,并探索其機制。 方法：觀察APS對過氧化氫誘導的C2C12成肌細胞凋亡的改善作用：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成4組,用含200μM和500μM過氧化氫的培養(yǎng)基培養(yǎng),并分別用0.2mg/mL APS進行干預作為藥物對照組,另設兩組作為空白對照組,孵育24h后用PI/Annexin V染色法檢測各組C2C12成肌細胞凋亡狀況；探索APS抗凋亡的分子機制：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成過氧化氫模型組與APS干預組,過氧化氫模型組用量設定為200μM, APS干預組用量設定0.2mg/mL,并另設正常對照組和APS對照組,孵育24h后用Western blot法對各組Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、B淋巴細胞瘤-2基因相關蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達量進行檢測；觀察APS對ROS的影響：將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成4組,用含200μM和500μM過氧化氫的培養(yǎng)基培養(yǎng),并分別用0.2mg/mL和0.5mg/mL APS進行干預作為藥物對照組,另設空白對照組,孵育30min后用DCFH-DA探針法檢測ROS濃度。 結果：APS對過氧化氫誘導的C2C12成肌細胞凋亡的改善作用：與正常對照組相比,200μM和500μM的過氧化氫組C2C12成肌細胞的凋亡率均明顯上升,與模型組相比,經APS干預后能顯著減少凋亡,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；探索APS抗凋亡的分子機制：與正常對照組相比,在過氧化氫模型組中,Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表達顯著增加,Bcl-2表達減少。相對于模型組,APS能夠顯著下調Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表達,恢復Bcl-2表達量,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05); APS對ROS的影響：與正常對照組相比,200gM和500μM過氧化氫組中ROS濃度顯著上升,0.2mg/mL和0.5mg/mL APS均能有效降低ROS濃度,以上比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論：APS對過氧化氫誘導的C2C12成肌細胞凋亡及OS均具有改善作用,其機制可能是能通過調節(jié)caspase8/caspase3以及Bcl-2/Bax兩條凋亡途徑實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692.5

【參考文獻】

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本文編號：1464443