本文關(guān)鍵詞：普羅布考對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠MDA、MLK3、P-P38、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

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【摘要】：目的:腎間質(zhì)纖維化(RIF)是慢性腎臟病進(jìn)展為終末期腎病的共同終點(diǎn),病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物,如α-SMA蛋白,分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),產(chǎn)生大量膠原蛋白并在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積。近年來研究表明,腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系,腎臟氧自由基的產(chǎn)生過多、清除減少,造成自由基產(chǎn)生及清除失衡是慢性腎間質(zhì)纖維化的重要致病機(jī)制之一。普羅布考在臨床上主要用于治療和預(yù)防心血管疾病,具有強(qiáng)抗氧化作用,據(jù)研究,普羅布考可通過抑制活性氧(ROS)的生成和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激,還可以通過下調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)化生長因子-β,TGF-β)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)保護(hù)受高糖影響的系膜細(xì)胞。參與腎間質(zhì)纖維化的多條信號通路能夠被氧化應(yīng)激激活,其中P38又稱為有絲分裂元活化蛋白激酶(MAPK)應(yīng)激信號通路,介導(dǎo)了細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程,在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中起重要作用。有研究證實(shí)氧化應(yīng)激激活后ROS生成增多,從而誘導(dǎo)MLK3表達(dá)上調(diào),激活下游的P38,使其磷酸化表達(dá)增加,最終導(dǎo)致Ⅲ型膠原表達(dá)增加,而普羅布考作為抗氧化劑,可通過抑制氧化應(yīng)激,進(jìn)而減少ROS產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^建立單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型并應(yīng)用普羅布考進(jìn)行干預(yù),觀察其對丙二醛(MDA)、MLK3、P-P38及Ⅲ型膠原在大鼠UUO模型中表達(dá)的影響,探討普羅布考減輕、延緩腎間質(zhì)纖維化,腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制,為延緩慢性腎臟病的進(jìn)展提供新的治療依據(jù)。方法:將54只清潔級健康雄性SD大鼠(體重180g±20g)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,編號后隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(Sham組,A組),UUO組(模型組,單側(cè)輸尿管結(jié)扎組,B組),治療組(普羅布考干預(yù)組,C組),每組各18只。于術(shù)前12小時(shí)開始禁食水,建立單側(cè)輸尿管梗阻模型。三組大鼠均于術(shù)前1天開始給藥,治療組(C組)給予普羅布考500mg/kg/d灌胃,假手術(shù)組、UUO組給予等量的生理鹽水灌胃。術(shù)后自由進(jìn)食飲水,每組分別于術(shù)后第3、7、14天各處死6只大鼠,留取左腎標(biāo)本,用0.9%生理鹽水充分沖洗后橫斷為四部分,取中間1/4固定于4%多聚甲醛中,用于制作病理切片,采用HE及Masson染色,觀察光鏡下大鼠腎組織病理改變及腎間質(zhì)纖維化程度,使用免疫組化技術(shù)檢測MLK3、P-P38、III型膠原在腎組織中的表達(dá)。余3/4分別置于標(biāo)記好的EP管中,-80℃冰箱凍存,用于丙二醛測試盒TBA法檢測腎組織MDA含量,Western Blot檢測P-P38表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果,應(yīng)用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察:光鏡下HE染色:A組,腎小管間質(zhì)中未見明顯異常;B組腎小管有擴(kuò)張、萎縮,小管上皮細(xì)胞脫落、空泡樣變性,腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞局部浸潤;C組和同時(shí)期B組相比,病變程度有所下降,但仍明顯比A組嚴(yán)重,UUO術(shù)后病變隨梗阻時(shí)間延長逐漸加重,正常結(jié)構(gòu)逐漸消失。光鏡下Masson染色:A組,腎間質(zhì)未見明顯膠原纖維表達(dá),結(jié)構(gòu)未見明顯異常;B組,可見輕度腎小管擴(kuò)張,少量藍(lán)色的膠原纖維組織在腎間質(zhì)內(nèi)沉積,并逐漸向腎小管周圍延伸且相互交織,形成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu);與同時(shí)期B組相比,C組的病變程度雖然減輕,但是仍明顯重于A組,腎小管病變、膠原纖維的表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長而進(jìn)行性加重、增多;2腎臟組織中MDA含量的TBA法檢測:A組,各時(shí)期腎組織中MDA的含量無明顯變化,B組,UUO術(shù)后第3天腎組織MDA含量與A組相比有所增加;術(shù)后第7天及第14天,腎組織MDA含量仍高于同時(shí)期A組(P均0.05);C組,術(shù)后第3、7、14天MDA的水平較同時(shí)期B組有所下降,但是仍明顯高于A組(P均0.05);3腎臟組織中MLK3、P-P38及Col-Ⅲ免疫組織化學(xué)染色:MLK3:A組,UUO術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞可見基礎(chǔ)量表達(dá);在3個(gè)時(shí)間點(diǎn),B組相較于A組,腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)內(nèi)明顯表達(dá),且隨梗阻時(shí)間的延長表達(dá)量呈遞增趨勢,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.05);C組,腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)強(qiáng)陽性表達(dá),表達(dá)量隨梗阻時(shí)間的延長進(jìn)行性升高,與同時(shí)期B組相較有所減輕,但是較同時(shí)相A組表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.05)。P-P38:A組,UUO術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)、細(xì)胞核都只有基礎(chǔ)水平的表達(dá);在3個(gè)時(shí)間點(diǎn),B組相較于A組,腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)、細(xì)胞核明顯表達(dá),且隨著梗阻時(shí)間的延長表達(dá)量進(jìn)行性增加(p均0.05);C組,腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)、細(xì)胞核強(qiáng)陽性表達(dá),表達(dá)量隨梗阻時(shí)間的延長進(jìn)行性升高,與同時(shí)期B組相較有所減輕,但是較同時(shí)相A組表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p均0.05)。Col-Ⅲ:A組,UUO術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)都僅基礎(chǔ)水平表達(dá);在3個(gè)時(shí)間點(diǎn),B組相較于A組,腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)表達(dá)明顯,隨著梗阻時(shí)間的延長表達(dá)量進(jìn)行性增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p均0.05);C組,腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)強(qiáng)陽性表達(dá),隨著梗阻時(shí)間延長表達(dá)逐漸增加,與同時(shí)期B組相比,表達(dá)有所下降,但是仍高于同時(shí)相A組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p均0.05);4腎臟組織中P-P38蛋白免疫印跡:A組,UUO術(shù)后P-P38蛋白均只有基礎(chǔ)水平表達(dá);與同時(shí)期A組相比,B組P-P38蛋白表達(dá)明顯增加,隨著梗阻時(shí)間的延長表達(dá)量進(jìn)行性增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);C組,P-P38明顯表達(dá),表達(dá)量隨梗阻時(shí)間延長進(jìn)行性增加,雖然低于同時(shí)期B組,但是仍高于同時(shí)期A組,各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p均0.05)。結(jié)論:MDA、MLK3、P-P38和Col-Ⅲ在UUO大鼠腎臟組織表達(dá)增加,且具有時(shí)間依賴性,說明UUO模型腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài),與P38MAPK信號通路激活有關(guān)。普羅布考干預(yù)組MDA、MLK3、P-P38和Col-Ⅲ表達(dá)低于同時(shí)期UUO組,表明UUO模型腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中普羅布考能夠抑制氧化應(yīng)激,降低此信號通路中MLK3、P-P38的表達(dá),進(jìn)而引起Col-Ⅲ表達(dá)下調(diào),起到延緩及減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。普羅布考減輕腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制之一可能是通過下調(diào)ROS,抑制氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)保護(hù)腎臟功能。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1297822