本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激在膜性腎病中的作用及機(jī)制

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【摘要】：目的:研究膜性腎病(membranous nephropathy,MN)發(fā)病過程中足細(xì)胞損傷機(jī)制,初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和氧化應(yīng)激在MN發(fā)病過程中的作用。方法:SD雄性大鼠85只,隨機(jī)分為5組:正常組(不預(yù)免,不免疫,其他實(shí)驗(yàn)組正式實(shí)驗(yàn)時(shí)予以隔日尾靜脈注射1ml生理鹽水(NS),同時(shí)NS1ml/d灌胃,n=20);模型組(按照改良的Border法予以C-BSA復(fù)制MN大鼠模型,同時(shí)NS 1ml/d灌胃,n=20);NAC1干預(yù)組(復(fù)制C-BSA MN大鼠模型,同時(shí)灌胃N-乙酰半胱氨酸(NAC)100mg/kg/d,n=20);NAC2干預(yù)組(復(fù)制C-BSA MN大鼠模型,同時(shí)灌胃NAC200mg/kg/d,n=20);NAC藥物對(duì)照組(不預(yù)免,不免疫,其他實(shí)驗(yàn)組正式實(shí)驗(yàn)時(shí)予以隔日尾靜脈注射1ml NS,同時(shí)灌胃NAC200mg/kg/d,n=5)。藥物對(duì)照組在正式免疫后第1、2、3、4周末檢測(cè)24h UTP,第4周殺檢;其余組在正式免疫后第1、2、3、4周分別隨機(jī)取5只大鼠殺檢,并于處死前檢測(cè)24h UTP;在各組殺檢時(shí)心臟取血檢查ALB、TG、TC等生化指標(biāo);采用分光光度法檢測(cè)血清中的SOD、MDA;取大鼠腎臟分別進(jìn)行光鏡、電鏡、免疫熒光鑒定成模情況及病理變化;用TUNEL法檢測(cè)各組腎小球固有細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI);免疫組化法檢測(cè)各組腎小球中GRP78、TRAF2、Caspase12、WT-1蛋白不同時(shí)間點(diǎn)的半定量,并根據(jù)WT-1免疫組化結(jié)果計(jì)算足細(xì)胞密度;相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果:⑴生化指標(biāo)變化正常組各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均正常;與正常組比較,模型組24h UTP、TG、TC呈時(shí)間依賴性升高,ALB隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展逐漸降低,24h UTP、ALB在第2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TG、TC在第3、4周均有明顯差異(P0.05);經(jīng)過NAC治療后,NAC1組、NAC2組24h UTP、TG、TC水平下降,ALB水平上升,第3、4周24h UTP較模型組均有顯著性差異(P0.05),第4周ALB較模型組均有顯著差異(P0.05),NAC2組TG于第4周接近正常,較模型組有明顯差異(P0.05);藥物對(duì)照組臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)較正常組無明顯異常。⑵腎臟形態(tài)學(xué)改變正常組與藥物對(duì)照組腎臟顏色正常,未見明顯形態(tài)學(xué)變化,無見電子致密物沉積,無免疫熒光沉積。與正常組比較,模型組隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,腎臟體積逐漸增大,色澤蒼白,病理損害逐漸加重,腎小球毛細(xì)血管袢熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng);第4周時(shí),模型組腎臟體積明顯增大,邊緣圓鈍,呈“大白腎”樣外觀,光鏡下見腎小球明顯腫脹,少部分球囊腔狹窄,基底膜(GBM)彌漫性增厚,足細(xì)胞側(cè)“釘突”形成,部分釘突頂部融合,呈“假雙軌”結(jié)構(gòu),腎間質(zhì)可見少許膠原纖維沉積,間質(zhì)明顯增寬,電鏡下可見上皮下大量電子致密物沉積,毛細(xì)血管袢免疫熒光強(qiáng)度+++-+++++。與模型組比較,NAC1組、NAC2組病理損傷明顯減輕,部分GBM增厚,呈“綢緞”樣空泡變性,少量“釘突”形成,少許免疫復(fù)合物在上皮下沉積,未見明顯“假雙軌”改變,兩組間免疫熒光強(qiáng)度較模型組稍減弱,但無顯著性差異。⑶腎小球固有細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化正常組與藥物對(duì)照組罕見細(xì)胞凋亡;模型組腎小球細(xì)胞凋亡較正常組明顯增多,第1、2、3、4周較正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,NAC1組、NAC2組腎小球細(xì)胞凋亡減少,第4周較模型組均有明顯差異(P0.05),但仍均高于正常組(P0.05)。⑷足細(xì)胞密度變化正常組各時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異;與正常組比較,模型組第1周足細(xì)胞密度開始減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,第2、3、4周明顯下降(P0.05);經(jīng)干預(yù)治療后,NAC1組、NAC2組足細(xì)胞密度較模型組略增大,于第4周出現(xiàn)明顯差異(P0.05),足細(xì)胞密度增大與NAC劑量有一定關(guān)系,但整個(gè)治療過程中同期比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組比較,藥物對(duì)照組第4周足細(xì)胞密度無明顯差異。⑸血清中SOD、MDA變化與正常組比較,模型組大鼠血清中SOD表達(dá)量呈應(yīng)激性升高,隨后呈時(shí)間依賴性下降,第1、2、3、4周均有顯著性差異(P0.05);模型組MDA呈升高趨勢(shì),第1、2、3、4周較正常組均有顯著性差異(P0.05);經(jīng)NAC干預(yù)后,NAC1組、NAC2組大鼠血清中SOD升高、MDA降低,在第3、4周較模型組均有明顯差異(P0.05),第4周NAC2組MDA接近正常組。⑹腎臟組織免疫組化結(jié)果正常組大鼠GRP78主要集中在腎小管細(xì)胞胞漿表達(dá),腎小球內(nèi)表達(dá)較少;與正常組比較,模型組GRP78表達(dá)位置相同,腎小球GRP78表達(dá)在實(shí)驗(yàn)前3周呈時(shí)間依賴性升高,隨后呈下降趨勢(shì),第1、2、3、4周較正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,NAC1、NAC2組腎小球GRP78表達(dá)減弱,第2周有明顯差異(P0.05);與正常組比較,NAC1、NAC2組第1、2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。正常組大鼠TRAF2表達(dá)量較少,主要集中在腎小球表達(dá),近遠(yuǎn)端小管少量表達(dá),集合管幾乎不表達(dá);與正常組比較,模型組腎小球TRAF2呈時(shí)間依賴性升高,第1、2、3、4周均有顯著性差異(P0.05);Caspase12在正常組大鼠少量表達(dá),主要定位在集合管和近遠(yuǎn)端小管細(xì)胞胞漿,腎小球少量表達(dá);與正常組比較,模型組腎小球Caspase12呈時(shí)間依賴性升高,第2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)NAC抗氧化處理后,NAC1、NAC2組腎小球TRAF2、Caspase12表達(dá)均減弱,在第3、4周較模型組均有顯著差異(P0.05),但仍較正常組升高(P0.05)。第4周藥物對(duì)照組的GRP78、TRAF2、Caspase12表達(dá)位置同正常組,其在腎小球表達(dá)較正常組均無明顯差異。⑺模型組各指標(biāo)相關(guān)性分析24h UTP與腎小球AI呈正相關(guān),與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān);SOD與24h UTP、腎小球AI呈負(fù)相關(guān),與足細(xì)胞密度呈正相關(guān);MDA與24h UTP、腎小球AI呈正相關(guān),與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān);腎小球Caspase12與足細(xì)胞密度呈顯著負(fù)相關(guān),與腎小球AI呈正相關(guān);腎小球AI與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:⑴氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與大鼠膜性腎病發(fā)病。⑵在大鼠膜性腎病發(fā)病過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期可能通過未折疊蛋白反應(yīng)起一定保護(hù)作用,晚期則可能通過活化TRAF2-Caspase12途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。⑶在大鼠膜性腎病發(fā)病過程中,氧化應(yīng)激可能通過介導(dǎo)TRAF2-Caspase12途徑的活化誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1272518