本文關(guān)鍵詞：人1α羥化酶的釀酒酵母表達及其活性研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建人1α羥化酶的真核表達載體,在釀酒酵母中進行誘導(dǎo)表達,研究其蛋白的表達及酶活性。為進一步探索重組蛋白1α羥化酶在CKD-MBD的治療中的應(yīng)用提供了新的啟示。方法:1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已知的1α羥化酶(AK314953)的基因序列,由長沙鵬遠生物有限公司進行生物合成,得到基因片段CYP27B1。2.依據(jù)GenBank上已知的該基因序列設(shè)計特異性引物,經(jīng)PCR擴增,回收和純化后,將目的基因CYP27B1和質(zhì)粒pYES2/CT分別進行雙酶切,回收和純化后,再將已酶切的目的基因CYP27B1與已酶切的質(zhì)粒pYES2/CT連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10,篩選測序鑒定。3.提取鑒定成功的重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1,以醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌INVSc1,篩選鑒定。4.將含重組質(zhì)粒的釀酒酵母菌INVSc1,加入半乳糖誘導(dǎo)重組蛋白CYP27B1的表達,同時設(shè)計空載組對照,SDS-PAGE和Western Blot對表達產(chǎn)物進行分析、鑒定。5.將表達目的蛋白的釀酒酵母表達菌INVSc1于含特定濃度25羥維生素D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時,同時設(shè)計空載組、釀酒酵母組對照,進行體外轉(zhuǎn)化實驗,鑒定其酶活性。結(jié)果:1.以1α羥化酶(AK314953)的基因序列為模板,通過PCR擴增獲得一約1.527Kb大小的目的片段,與Genbank上1α羥化酶基因片段大小符合。2.構(gòu)建的含重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1的大腸桿菌,經(jīng)菌液PCR、HindIII及Eco RI雙酶切及測序鑒定,結(jié)果顯示與Genbank上1α羥化酶基因序列完全一致。3.利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法成功將重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌INVSc1,經(jīng)菌落PCR擴增獲得一約1.527Kb大小的目的片段,與目的基因片段大小符合。4.重組釀酒酵母菌INVSc1經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:釀酒酵母表達菌INVSc1成功表達了一相對分子質(zhì)量約為72KDa的目的蛋白,與理論相符合,且目的蛋白在表達菌中以可溶性蛋白的形式表達;Western Blot分析結(jié)果顯示:在約72KDa處有一特異性條帶,與預(yù)期蛋白相對分子質(zhì)量相符合。5.體外轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的25羥維生素D經(jīng)釀酒酵母基因工程菌分解后濃度明顯下降,與空載組、釀酒酵母組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),證實重組蛋白1α羥化酶具有酶活性。結(jié)論:人1α羥化酶基因成功構(gòu)建到釀酒酵母菌INVSc1中,能表達1α羥化酶,并具有酶活性。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李海明;張倩;盧燕雯;倪麗;王少清;張力胤;顧勇;郝傳明;陳靖;;高磷通過局部環(huán)氧化酶2途徑刺激尿毒癥患者甲狀旁腺細胞增生[J];中華腎臟病雜志;2012年01期

2 生杰;趙久陽;;慢性腎臟病患者的心血管鈣化[J];中國血液凈化;2012年01期

3 陳珊;;啤酒發(fā)酵主要副產(chǎn)物的應(yīng)用[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2011年02期

4 吳麗娟,蔣建新,朱佩芳,王正國,康格非;酵母表達系統(tǒng)及其應(yīng)用研究[J];生命的化學(xué);2003年01期

5 邵明麗,許梓榮;酵母細胞壁對動物機體的免疫作用及其作用機理[J];飼料研究;2002年05期

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本文編號：1217958