本文關(guān)鍵詞：人1α羥化酶的釀酒酵母表達(dá)及其活性研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建人1α羥化酶的真核表達(dá)載體,在釀酒酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),研究其蛋白的表達(dá)及酶活性。為進(jìn)一步探索重組蛋白1α羥化酶在CKD-MBD的治療中的應(yīng)用提供了新的啟示。方法:1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已知的1α羥化酶(AK314953)的基因序列,由長(zhǎng)沙鵬遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行生物合成,得到基因片段CYP27B1。2.依據(jù)GenBank上已知的該基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,回收和純化后,將目的基因CYP27B1和質(zhì)粒pYES2/CT分別進(jìn)行雙酶切,回收和純化后,再將已酶切的目的基因CYP27B1與已酶切的質(zhì)粒pYES2/CT連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10,篩選測(cè)序鑒定。3.提取鑒定成功的重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1,以醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌INVSc1,篩選鑒定。4.將含重組質(zhì)粒的釀酒酵母菌INVSc1,加入半乳糖誘導(dǎo)重組蛋白CYP27B1的表達(dá),同時(shí)設(shè)計(jì)空載組對(duì)照,SDS-PAGE和Western Blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析、鑒定。5.將表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母表達(dá)菌INVSc1于含特定濃度25羥維生素D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí),同時(shí)設(shè)計(jì)空載組、釀酒酵母組對(duì)照,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),鑒定其酶活性。結(jié)果:1.以1α羥化酶(AK314953)的基因序列為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得一約1.527Kb大小的目的片段,與Genbank上1α羥化酶基因片段大小符合。2.構(gòu)建的含重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1的大腸桿菌,經(jīng)菌液PCR、HindIII及Eco RI雙酶切及測(cè)序鑒定,結(jié)果顯示與Genbank上1α羥化酶基因序列完全一致。3.利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法成功將重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP27B1轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌INVSc1,經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增獲得一約1.527Kb大小的目的片段,與目的基因片段大小符合。4.重組釀酒酵母菌INVSc1經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:釀酒酵母表達(dá)菌INVSc1成功表達(dá)了一相對(duì)分子質(zhì)量約為72KDa的目的蛋白,與理論相符合,且目的蛋白在表達(dá)菌中以可溶性蛋白的形式表達(dá);Western Blot分析結(jié)果顯示:在約72KDa處有一特異性條帶,與預(yù)期蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符合。5.體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的25羥維生素D經(jīng)釀酒酵母基因工程菌分解后濃度明顯下降,與空載組、釀酒酵母組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),證實(shí)重組蛋白1α羥化酶具有酶活性。結(jié)論:人1α羥化酶基因成功構(gòu)建到釀酒酵母菌INVSc1中,能表達(dá)1α羥化酶,并具有酶活性。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：1217958