本文關(guān)鍵詞：小鼠睪丸3D培養(yǎng)體系的建立與成年小鼠精原干細(xì)胞富集方法的研究

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【摘要】：睪丸中精子發(fā)生異常是造成男性不育的一個(gè)主要原因,在臨床上主要表現(xiàn)為少精、無(wú)精或精子畸形。為此,我們以小鼠正常睪丸組織支架作為3D培養(yǎng)支架,在體外對(duì)乳鼠睪丸細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng),期望建立體外生產(chǎn)精子的技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)3D培養(yǎng)我們成功獲得進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期的細(xì)胞。并且進(jìn)一步研究了從成年小鼠睪丸中分離精原干細(xì)胞的方法。主要研究結(jié)果如下：1.小鼠睪丸支架的制備：采用不同濃度的SDS對(duì)周齡為4-5w的昆明白小鼠睪丸處理不同的時(shí)間制備睪丸支架,然后對(duì)制備的支架進(jìn)行組織學(xué)及生物化學(xué)的檢測(cè),篩選出制備小鼠睪丸支架的最佳條件,即1% SDS處理24h。2.乳鼠睪丸細(xì)胞的制備：從出生后5-7d的乳鼠睪丸中分離睪丸細(xì)胞,然后將其注射到小鼠睪丸支架中,進(jìn)行體外3D培養(yǎng)。通過(guò)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)、RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)了精子發(fā)生中不同階段的細(xì)胞特異標(biāo)記基因的表達(dá),結(jié)果表明睪丸支架能夠在體外支持乳鼠睪丸細(xì)胞的分化。3.分離純化成年小鼠精原干細(xì)胞：采用兩步酶消化法分離周齡為6-8w的昆明白小鼠的睪丸細(xì)胞,然后對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng),通過(guò)堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、移植、RT-PCR檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)等一系列分析、鑒定,證明成年小鼠睪丸細(xì)胞在體外培養(yǎng)3d后再用MACS方法分選精原干細(xì)胞,能夠顯著提高精原干細(xì)胞的數(shù)量。本研究為建立更為可靠的精子體外成熟的方法探索了一條可能的新路,為研究人精子體外發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：睪丸 細(xì)胞外基質(zhì) 精原干細(xì)胞 3D培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞表8-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 睪丸12-16
• 1.1.1 睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.1.2 精子發(fā)生過(guò)程13-14
• 1.1.3 支持細(xì)胞14-15
• 1.1.4 精子發(fā)生的調(diào)控15
• 1.1.5 生殖細(xì)胞中的分子標(biāo)記15-16
• 1.2 細(xì)胞外基質(zhì)16-21
• 1.2.1 制備天然組織的ECM16-19
• 1.2.2 脫細(xì)胞后ECM的檢測(cè)19
• 1.2.3 ECM中殘留化學(xué)試劑的清除19
• 1.2.4 ECM作為生物支架的應(yīng)用19-20
• 1.2.5 ECM的研究進(jìn)展20-21
• 1.3 精原干細(xì)胞的培養(yǎng)21
• 1.4 SSCs體外誘導(dǎo)精子發(fā)生21
• 1.5 結(jié)語(yǔ)21-22
• 第二章 制備小鼠睪丸支架22-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器耗材22
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑22
• 2.1.4 重要溶液的配制22-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 2.2.1 小鼠睪丸脫細(xì)胞24-25
• 2.2.2 小鼠睪丸ECM組織學(xué)染色25-27
• 2.2.3 小鼠睪丸ECM生化成分測(cè)定27-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-46
• 2.3.1 小鼠睪丸ECM的組織學(xué)染色結(jié)果30-35
• 2.3.2 小鼠睪丸ECM生化成分測(cè)定結(jié)果35-46
• 2.4 討論46
• 2.5 小結(jié)46-47
• 第三章 新生小鼠睪丸細(xì)胞3D培養(yǎng)與鑒定47-58
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料47
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材47
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑47
• 3.1.3 重要溶液配制47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法47-52
• 3.2.1 制備睪丸支架47-48
• 3.2.2 分離乳鼠睪丸細(xì)胞48
• 3.2.3 向睪丸支架體注射乳鼠睪丸細(xì)胞48-49
• 3.2.4 3D培養(yǎng)后的鑒定49-52
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-56
• 3.3.1 組織學(xué)染色結(jié)果52-53
• 3.3.2 免疫組化染色結(jié)果53-54
• 3.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果54-55
• 3.3.4 RT-PCR基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果55-56
• 3.4 討論56-57
• 3.5 小結(jié)57-58
• 第四章 成年小鼠精原干細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng)58-73
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材58
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑58
• 4.1.3 重要溶液配制58-59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法59-65
• 4.2.1 分離成年小鼠精原干細(xì)胞59-60
• 4.2.2 精原干細(xì)胞的純化60-62
• 4.2.3 精原干細(xì)胞鑒定62-63
• 4.2.4 成年小鼠精原干細(xì)胞純化效率提高鑒定63-65
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-71
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果65-66
• 4.3.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果66-67
• 4.3.3 免疫熒光染色結(jié)果67-68
• 4.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果68-70
• 4.3.5 RT-PCR基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果70-71
• 4.4 討論71-72
• 4.5 小結(jié)72-73
• 結(jié)論73-74
• 致謝74-75
• 參考文獻(xiàn)75-79

【相似文獻(xiàn)】

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