本文關(guān)鍵詞：Shox2基因轉(zhuǎn)染犬骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)與功能檢測

  更多相關(guān)文章： Shox2 共培養(yǎng) 間充質(zhì)干細胞 起搏離子流

【摘要】：背景和目的病竇綜合征(sick sinus syndrome)是一種常見的嚴重威脅患者生命的緩慢性心律失常,臨床無特效藥物可以根治,主要治療手段是植入人工電子起搏器。雖然電子起搏器的植入能有效改善癥狀、挽救患者生命,但仍存在許多問題:如應(yīng)激狀態(tài)下缺乏有效的生物反應(yīng)性、電池使用時間有限、異物植入、外周電磁場干擾等。因此,當前心臟電生理領(lǐng)域研究的一大熱點就是構(gòu)建一種具有自主搏動能力的 生物心臟起搏器‖,以取代電子起搏器。超極化啟動的環(huán)核苷酸門控通道(HCN)的基因亞型HCN4及其介導(dǎo)的起搏離子流(If)是竇房結(jié)細胞4期自動去極化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究表明,圍繞HCN基因開展的重建生物起搏點的實驗方法,都存在著移植后起搏功能退化或消失的現(xiàn)象。由此可見,僅僅重建If的離子通道無法形成持久有效的生物起搏點。有研究發(fā)現(xiàn)參與胚胎心臟早期發(fā)育的矮小同源盒基因亞型2(Shox2)能夠顯著抑制Nkx2.5并有效上調(diào)HCN4的表達,是調(diào)控胚胎心臟細胞向竇房結(jié)細胞分化的關(guān)鍵因素。因此,利用Shox2作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子誘導(dǎo)多能干細胞向竇房結(jié)樣細胞分化,是生物起搏研究的一種理想選擇。本研究在國家自然科學(xué)基金(81270246)資助下,將構(gòu)建好的攜帶mShox2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)后進行體外誘導(dǎo)分化,運用WB和膜片鉗等實驗方法對Shox2-MSCs進行相關(guān)的生理生化檢查,以期探討過表達Shox2基因的cMSCs作為一種生物起搏的 種子細胞‖的可行性。研究方法1.選取健康成年犬一只,麻醉后抽取骨髓,密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)cMSCs,倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)特征,流式細胞儀鑒定。2.根據(jù)NCBI小鼠Shox2 mRNA序列構(gòu)建包裝慢病毒載體pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP,載體內(nèi)攜帶嘌呤霉素抗藥基因用于細胞純化。3.利用構(gòu)建好的兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)染cMSCs,并進行實驗分組,將轉(zhuǎn)染后的細胞與心肌細胞(CMs),再利用嘌呤霉素純化誘導(dǎo)后的cMSCs。4.利用wb、實時定量pcr和免疫熒光技術(shù)檢測實驗組細胞cx43/45、hcn4、tbx3、nkx2.5等心肌細胞特異性基因的表達情況。5.全細胞膜片鉗技術(shù)檢測誘導(dǎo)分化后shox2-cmscs和對照組的離子流通道動力學(xué)特征。結(jié)果1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)cmscs,第3代可得到純化的呈典型多邊形或長梭形的細胞,胞體飽滿,折光性好,具有良好的增殖能力和誘導(dǎo)分化潛能。流式細胞儀篩查,cd44和cd29高表達(93.2±3.6%),不表達cd34和cd45,符合mscs特性。2.在轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)moi=20的情況下,72h后熒光顯微鏡下觀察慢病毒對mscs的轉(zhuǎn)染效率可以達到(85±4.5)%(n=5)。慢病毒轉(zhuǎn)染能力好,細胞生長活性未見明顯改變。3.取轉(zhuǎn)染陽性的cmscs行體外誘導(dǎo)分化后分為4組:a組(rfp-cmscs組)、b組(rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組)、c組(shox2-rfp-cmscs組)、d組(shox2-rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組)。4.shox2-rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組細胞經(jīng)過共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)特異性基因hcn4、cx45、tbx3的表達較其他組明顯增加(p0.05),而rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組細胞的nkx2.5及cx43的表達與其他三組相比明顯增加。5.全細胞膜片鉗結(jié)果顯示,shox2-rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組細胞可以記錄到超極化啟動的內(nèi)向電流,該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性,且對cs+敏感。根據(jù)記錄到的尾電流重建該內(nèi)向電流啟動曲線和翻轉(zhuǎn)電位,并進行計算,得到半數(shù)最大激活電壓為-89.4±3.7mv,斜率為-16.3±1.5,翻轉(zhuǎn)電位是-28.9±6.7mv。而僅轉(zhuǎn)染rfp的rfp-cmscs組和rfp-cmscs+cms共培養(yǎng)組細胞,未能記錄到超極化啟動的內(nèi)向電流。結(jié)論1.應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)法,早期就可以得到純化的mscs,具有良好的增殖活性和多向分化潛能。2.構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,shox2-mscs組細胞穩(wěn)定表達shox2蛋白,有功能性hcn4通道出現(xiàn)。僅轉(zhuǎn)染rfp的mscs未能檢測到hcn4蛋白。3.shox2-mscs與cms共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后,高表達cx45、tbx3及hcn4,符合心臟傳導(dǎo)組織的表達特征。對照組細胞高表達cx43、nkx2.5,與工作心肌細胞表面標志物一致。4.Shox2基因修飾的MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后,具備了起搏樣細胞的電生理特征,可以記錄到起搏離子流If,其檢出率高于未經(jīng)誘導(dǎo)分化的Shox2-MSCs。轉(zhuǎn)RFP組和RFP-MSCs+CMs組細胞未記錄到起搏離子流。
【關(guān)鍵詞】：Shox2 共培養(yǎng) 間充質(zhì)干細胞 起搏離子流
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.7
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 犬骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定14-22
• 2.1 材料和方法14-16
• 2.2 結(jié)果16-20
• 2.3 討論20-22
• 第三章 慢病毒載體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)染及體外誘導(dǎo)分化22-32
• 3.1 材料和方法22-25
• 3.2 結(jié)果25-30
• 3.3 討論30-32
• 第四章 轉(zhuǎn)染Shox2基因的c MSCs體外誘導(dǎo)分化后的功能檢測32-45
• 4.1 材料和方法32-37
• 4.2 結(jié)果37-42
• 4.3 討論42-45
• 全文總結(jié)45-46
• 本研究的局限性46-47
• 參考文獻47-52
• 文獻綜述 竇房結(jié)分子機制和生物起搏治療的研究進展52-61
• 參考文獻57-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間論文發(fā)表情況61-62
• 致謝62

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 范紅旗;孫輝生;;骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化研究進展[J];臨床軍醫(yī)雜志;2006年03期

2 吳曉林;李冬民;馬德茂;張曉田;黃石;宋天保;;骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化與標記[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年21期

3 鐘曉琳;王忠瓊;萬居易;李昌平;;骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞的體外誘導(dǎo)分化[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年02期

4 趙宇;劉嘉暉;呂剛;;大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外誘導(dǎo)分化的研究[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2007年03期

5 朱淑霞;李永華;宋治遠;羅向東;仝識非;;電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化時細胞增殖[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年05期

6 王春雪,萬虹,歷俊華,王擁軍,毛淑靜,劉麗萍,翟晶;大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞實驗研究[J];中國康復(fù)理論與實踐;2004年08期

7 何旭,劉丹丹,王陽,郭新,李玉林;人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及血管內(nèi)皮生長因子對其體外誘導(dǎo)分化作用[J];中國免疫學(xué)雜志;2004年09期

8 林玲,鄭志z，

本文編號：940336