本文關(guān)鍵詞：全反式維甲酸干預鼠胚神經(jīng)干細胞聯(lián)合GDNF、ChABC移植對脊髓損傷修復的研究

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【摘要】：目的:觀察1.0μmol/L全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干預培養(yǎng)鼠胚神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)聯(lián)合膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)共同移植至大鼠脊髓橫斷損傷部位后,移植神經(jīng)元存活情況和大鼠神經(jīng)功能障礙恢復情況。方法:ATRA(1.0μmol/L)干預胎鼠腦組織神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)由本課題前期實驗完成并凍存。移植前行凍存細胞復蘇,并于移植前1d用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Brdu-2-deoxy-uridine,Brd U)標記。雌性Sprague-Dawleg(SD)大鼠60只,體重210~250g,隨機分為假手術(shù)組(A組,n=12)、損傷對照組(B組,n=12)、NSCs聯(lián)合GNDF移植組(C組,n=12)、NSCs聯(lián)合Ch ABC移植組(D組,n=12)、NSCs聯(lián)合GDNF+Ch ABC移植組(E組,n=12)。大鼠均采用2%戊巴比妥鈉(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉。損傷對照組、移植組大鼠于T10平面顯露并橫斷脊髓、蛛網(wǎng)膜下腔留置PE-10導管。假手術(shù)組僅行椎板切除、硬脊膜顯露和蛛網(wǎng)膜下腔留置PE-10導管,不損傷脊髓。術(shù)后第8d,C、D、E組大鼠微量注射器注入Brd U標記NSCs 10μL(細胞濃度:2×105個/μL),A、B組緩慢注射生理鹽水10μL對照。C組繼續(xù)注射GDNF 10μL(10ug/m L)、生理鹽水10μL(共20μL/d,連續(xù)7d),D組注射Ch ABC 10μL(5U/m L)、生理鹽水10μL(共20μL/d,連續(xù)7d),E組注射GDNF 10μL(10ug/m L)、Ch ABC 10μL(5U/m L)(共20μL/d,連續(xù)7d);A、B組大鼠通過微量注射器經(jīng)留置導管注射生理鹽水20μL/d,連續(xù)7d。每組大鼠于術(shù)前1d、術(shù)后7d、末次推注細胞因子后1、2、5、8w各時間點,采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分評估大鼠雙后肢運動功能,采用體感誘發(fā)電位(Somatosensory evoked potentials,SEP)評估脊髓損傷后神經(jīng)傳導功能恢復情況。建模術(shù)前BBB評分小于21分大鼠被排除本研究。移植8w后,大鼠再次采用戊巴比妥鈉(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉,生理鹽水和4%中性多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注固定。沿原切口暴露損傷脊髓并取損傷節(jié)段脊髓組織行HE染色觀察損傷區(qū)域改變;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine,Brd U)、膠質(zhì)纖維蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗體行免疫組織熒光雙標染色觀察移植NSCs細胞存活以及軸突生長情況。統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0系統(tǒng)軟件進行分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗進行分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:(1)后肢功能障礙BBB評分結(jié)果:術(shù)后7d,損傷對照組、移植組BBB評分較假手術(shù)組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);損傷對照組、移植組各組之間比較,BBB評分差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05);在移植2w后,移植組大鼠雙側(cè)后肢功能障礙逐步恢復,BBB評分較損傷對照組高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);在移植5w后,大鼠后肢功能障礙以E組恢復最好,BBB評分較C、D組高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)SEP潛伏期評估結(jié)果:手術(shù)建模術(shù)后7d時,損傷對照組、移植組大鼠SEP潛伏期較假手術(shù)組明顯延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),損傷對照組、移植組組間SEP潛伏期比較,差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。末次移植2w后,各移植組大鼠SEP潛伏期開始縮短,移植組與損傷對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);移植5w后,E組SEP潛伏期較C、D組縮短更為明顯,差異仍具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)HE染色觀察:假手術(shù)組大鼠灰、白質(zhì)分界清楚,神經(jīng)纖維束排列規(guī)則,細胞輪廓清楚、結(jié)構(gòu)完整;損傷對照組損傷區(qū)血管形態(tài)欠完整,細胞排列紊亂,可見囊腔及膠質(zhì)瘢痕形成;移植組損傷區(qū)域細胞增生明顯,膠質(zhì)瘢痕形成,膠質(zhì)瘢痕周圍見細胞增生明顯,壞死空洞較損傷對照組明顯縮小。(4)免疫組織熒光雙標染色觀察及陽性細胞計數(shù)結(jié)果:A、B組未見Brd U標記陽性細胞表達,移植組見Brd U陽性細胞存活。Brd U陽性細胞計數(shù):C組平均95.2±10.2個,D組平均92.7±8.9個,E組平均109.0±10.8個,E組細胞計數(shù)較C、D組多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。GFAP陽性細胞計數(shù):C組平均13.5±2.5個,D組平均12.9±1.9個,E組平均10.3±2.1個,E組GFAP陽性細胞較C、D組少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。MAP-2免疫組織熒光染色陽性細胞計數(shù)提示,C組平均11.7±2.2個,D組平均10.6±2.4個,E組平均14.1±2.3個,E組陽性細胞計數(shù)多于C、D組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.經(jīng)ATRA干預培養(yǎng)的NSCs移植可促進大鼠損傷脊髓功能恢復;2.經(jīng)ATRA干預的NSCs聯(lián)合GDNF、Ch ABC因子移植對大鼠損傷脊髓功能障礙恢復較ATRA干預NSCs分別聯(lián)合GDNF、Ch ABC臨床效果更佳;3.GDNF、Ch ABC在NSCs移植治療大鼠脊髓損傷過程中具有協(xié)同作用。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細胞 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) 硫酸軟骨素酶ABC 脊髓損傷 聯(lián)合移植
【學位授予單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-25
• 結(jié)果25-29
• 附圖29-35
• 討論35-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-47
• 英漢縮略詞對照表47-48
• 致謝48-49
• 神經(jīng)干細胞、GDNF和Ch ABC在脊髓損傷治療過程中的作用及研究進展（綜述）49-61
• 參考文獻56-61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 柴宏偉;朱濤;;硫酸軟骨素酶ABC治療脊髓損傷的研究進展[J];國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志;2008年05期

2 傅強,侯鐵勝,魯凱伍,李明,石志才,趙杰;大鼠胸段脊髓損傷后后肢運動功能不同評價標準的比較研究[J];中國脊柱脊髓雜志;2001年05期

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本文編號：932521