本文關(guān)鍵詞：基于FXR的蒲公英乙酸乙酯提取物利膽作用研究

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【摘要】：背景：膽汁淤積(Cholestasis),又稱為膽汁淤積綜合征,指在肝細(xì)胞或膽管水平膽汁生成、分泌或流動(dòng)障礙,導(dǎo)致膽汁不能正常進(jìn)入十二指腸的一組疾病共同的臨床癥狀,而引起黃疽、皮膚瘙癢等癥狀的綜合征。膽汁淤積主要包括肝外膽汁淤積和肝內(nèi)膽汁淤積兩大類,是許多肝膽疾病共有的基礎(chǔ)病變,其病因包括病毒感染、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、藥物性肝損、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積等多種因素,因此膽汁淤積癥是內(nèi)科臨床上的常見綜合癥,發(fā)病率極高(如妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病率高達(dá)13%),嚴(yán)重威脅人類健康。蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)具有清熱解毒,消腫散結(jié),利尿通淋功效,臨床上對(duì)慢性膽囊痙攣及結(jié)石癥有效。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn),蒲公英能促進(jìn)正常大鼠膽汁分泌,保護(hù)肝細(xì)胞的藥理活性,有望開發(fā)成為一種臨床上治療膽汁淤積的新藥。但其作用機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。因此,利用現(xiàn)代化分析手段和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)利膽的中草藥如蒲公英作用于機(jī)體的信號(hào)通路進(jìn)行探索,進(jìn)一步研究蒲公英保肝利膽的分子機(jī)制,不僅為開發(fā)安全有效的抗膽汁淤積藥物提供新的研究思路,還可指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥,具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究目的：研究蒲公英乙酸乙酯提取物(The Ethyl Acetate Extract Of Taraxacum, TEE)與咖啡酸(Caffeic acid)通過法尼醇受體(Farnesoid X receptor, FXR)及其靶基因膽固醇7a羥化酶(Cholesterol 7a-hydroxylase, CYP7A1)膽鹽輸出泵(Bilesalt export pump, Bsep)對(duì)α-萘異硫氰酸酯(a-naphthylisothiocyanate, ANIT)誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠護(hù)肝利膽的作用及機(jī)制。方法：1.觀察膽汁淤積模型大鼠灌服蒲公英正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物后,對(duì)膽汁排泄、肝功能等生化指標(biāo)表達(dá)的影響。模型組灌胃給予α-萘異硫氰酸酯ANIT (100 mg/kg)造成急性肝內(nèi)膽汁郁積模型。蒲公英正丁醇提取物組灌胃給予蒲公英正丁醇提取物及灌服ANIT(100mg/kg)造模。蒲公英乙酸乙酯提取物組灌胃給予蒲公英乙酸乙酯提取物及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。蒲公英石油醚提取物組灌胃給予蒲公英石油醚提取物及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予熊去氧膽酸(50mg/Kg)及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。模型對(duì)照組灌胃給予0.5% CMC-Na溶液和植物油(用于溶解ANIT的溶劑)作為模型對(duì)照。各組大鼠末次藥后2h,腹腔注射20%烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,進(jìn)行膽管插管手術(shù),收集膽汁、全身血液和肝臟。測(cè)定膽汁流,稱量肝重,檢測(cè)肝功能相關(guān)生化指標(biāo)(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血漿中總膽紅素(TB)和總膽汁酸(TBA))的含量。2.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)的急性毒性考察。將100只昆明(KM)小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為10組,每組10只,雌雄各半。按最大劑量開始給藥,之后以0.75倍遞減,給藥4h后正常飼養(yǎng),觀察7 d。3.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)指征成分咖啡酸在正常大鼠和ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠中的藥動(dòng)學(xué)比較建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏的生物樣品中咖啡酸的HPLC檢測(cè)方法,并且對(duì)專屬性、靈敏度、線性范圍、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等方法學(xué)進(jìn)行確認(rèn)。正常大鼠和ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠灌服TEE,測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度,計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù),比較TEE在正常大鼠和ANIT誘導(dǎo)后48h的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠血漿內(nèi)血藥濃度的差異。4.觀察膽汁淤積模型大鼠分別灌服TEE及咖啡酸高中低三個(gè)劑量后,對(duì)膽汁排泄、肝功能等生化指標(biāo)、膽汁池、病理切片分析、肝臟中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表達(dá)及其蛋白表達(dá)的差異性。模型組灌胃給予(100 mg/kg)造成急性肝內(nèi)膽汁郁積模型。TEE(高中低)組灌胃給予相應(yīng)劑量的TEE及灌服ANIT (100 mg/kg)造模�？Х人峤M灌胃給予相應(yīng)劑量的咖啡酸及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予熊去氧膽酸(50mg/Kg)及灌服ANIT (100 mg/k g)造模。模型對(duì)照組灌胃給予0.3%CMC-Na溶液和植物油作為模型對(duì)照。各組大鼠末次藥后2h,腹腔注射20%烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,進(jìn)行膽管插管手術(shù),收集膽汁、全身血液和肝臟。測(cè)定膽汁流,稱量肝重,檢測(cè)肝功能相關(guān)生化指標(biāo)(ALT、AST、ALP、TB和TBA的含量和對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理切片分析。采用LC-MS/MS檢測(cè)膽汁池中的17種膽酸成分并采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)肝臟中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表達(dá)水平及Western Blot測(cè)定其蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果：1.在ANIT灌胃造成大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積實(shí)驗(yàn)中,與模型對(duì)照組比較,模型組膽汁排泄量和膽汁中TB, TBA的含量均降低(P0.05),肝比重增大(P0.05),血漿中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA的含量升高(P0.05)。肝臟勻漿液中TBA和TB含量升高(P0.05)。分別給藥后發(fā)現(xiàn),正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物組,與模型組比較,乙酸乙酯提取物組能顯著增加膽汁排泄量(P0.05),降低血漿中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA和肝臟中TB、DB、TBA的含量(P0.05),以及顯著提高膽汁中TB的含量(P0.05)。2.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)半數(shù)致死量LD50=306.25mg/kg,95%的可信限=249.75-376.99mg/kg。小鼠死亡原因可能為肝臟局部缺血性壞死。3.咖啡酸的血藥濃度在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9994),日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度等方法學(xué)均符合要求,血漿中無(wú)內(nèi)源性基質(zhì)干擾,穩(wěn)定性良好。與正常大鼠相比,TEE在急性膽汁淤積模型大鼠組的AUC(33.15±2.97vs 9.61±0.76)更大,但清除率(1.97±0.26 vs 5.73±0.37)較小。4.在ANIT灌胃造成大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積實(shí)驗(yàn)中,與模型組比較,TEE高中劑量組膽汁排泄量、膽汁池和膽汁中TBA的含量均升高(P0.05),血漿中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量降低(P0.05),肝臟勻漿液中TBA含量降低(P0.05),病理切片下觀察肝臟損害情況顯著減輕。在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上,TEE能增加肝臟中FXR、CYP7A1、Bsep基因和蛋白的表達(dá)(P0.05)。而蒲公英有效成分咖啡酸能使膽汁排泄量、膽汁池和膽汁中TB、TBA的含量均升高(P0.05),血漿中AST、ALP、TB、TBA的含量降低(P0.05),肝臟勻漿液中TB含量降低(P0.05)；病理切片下觀察肝臟損害情況無(wú)明顯改善；在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上,咖啡酸能增加肝臟中FXR、Bsep基因和蛋白的表達(dá)(P0.05),對(duì)CYP7A1的作用比TEE低。結(jié)論：蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)及其活性成分咖啡酸能不同程度地緩解ANIT導(dǎo)致的膽汁異常蓄積和返流入血的病變,從而減少黃疸,改善肝功能；TEE能刺激FXR表達(dá)的上調(diào),表達(dá)增強(qiáng)的FXR反饋性抑制膽汁酸合成酶CYP7A1的表達(dá),減少膽汁酸的合成,激活肝細(xì)胞膜上Bsep的轉(zhuǎn)錄,加速膽汁酸從肝細(xì)胞向膽小管的外排轉(zhuǎn)運(yùn)；這可能是TEE通過FXR調(diào)控膽汁酸的合成和代謝利膽護(hù)肝的作用機(jī)制之一,表現(xiàn)了其保肝利膽、抗膽汁郁積的作用。
【關(guān)鍵詞】：膽汁淤積 蒲公英 咖啡酸 FXR
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 引言14-16
• 第一章 文獻(xiàn)研究16-27
• 第一節(jié) 膽汁淤積相關(guān)性研究進(jìn)展16-24
• 第二節(jié) 中醫(yī)藥與膽汁淤積24-25
• 第三節(jié) 蒲公英近年的研究進(jìn)展25-27
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究27-70
• 第一節(jié) 蒲公英水煎液的利膽作用研究27-32
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>27
• 二、實(shí)驗(yàn)材料27
• 三、實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 四、指標(biāo)檢測(cè)29
• 五、結(jié)果與分析29-32
• 第二節(jié) 蒲公英有效部位的篩選實(shí)驗(yàn)32-40
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>32
• 二、實(shí)驗(yàn)材料32
• 三、實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 四、指標(biāo)檢測(cè)34
• 五、結(jié)果與分析34-40
• 第三節(jié) 蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)化學(xué)成分分析與制備條件優(yōu)化40-43
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>40
• 二、實(shí)驗(yàn)材料40
• 三、實(shí)驗(yàn)方法40
• 四、結(jié)果與分析40-43
• 第四節(jié) 蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)的急性毒性考察43-46
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>43
• 二、實(shí)驗(yàn)材料43
• 三、實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 四、結(jié)果與分析44-46
• 第五節(jié) TEE中咖啡酸在正常大鼠與膽汁淤積模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究46-49
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>46
• 二、實(shí)驗(yàn)材料46
• 三、實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 四、結(jié)果與分析47-49
• 第六節(jié) TEE,咖啡酸對(duì)膽汁淤積模型大鼠利膽作用的對(duì)比49-70
• 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>49
• 二、實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 三、實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 四、指標(biāo)檢測(cè)52-69
• 五、小結(jié)69-70
• 結(jié)語(yǔ)70-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 附錄78-79
• 在校期間發(fā)表論文情況79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：861332