本文關鍵詞：JIP3調節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的研究

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【摘要】：背景大腦皮層是大腦中最大的結構,它由很多神經(jīng)元構成。大腦皮層是大腦結構中最為復雜的區(qū)域,發(fā)育完全的大腦皮層可以形成高度有序的六層層狀結構。皮層形成的六層獨特結構由不同形態(tài)及功能的細胞構成,其對于皮層神經(jīng)環(huán)路形成、認知功能、情感以及意識都具有重要的作用。因此,在發(fā)育過程中,新生的神經(jīng)元準確的遷移到其最終的位置對于實現(xiàn)大腦的諸多功能是至關重要的,例如對于形成皮層精確的層狀結構以及后續(xù)神經(jīng)環(huán)路的形成都是必不可少的。已有研究證實,皮層神經(jīng)元可以從室管膜區(qū)/室管膜下區(qū)的神經(jīng)前體細胞分裂產(chǎn)生,然后沿著放射性膠質細胞進行放射狀遷移,通過intermediate zone到達發(fā)育中的corticalplate。目前對于皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制研究,已有很多信號通路如reelin信號通路、JNK信號通路等被報道參與到神經(jīng)元的遷移,但具體參與調控的分子機制仍在繼續(xù)研究。JIP3是JNK信號通路的一個支架蛋白,它在成年的大腦中有高表達。在老鼠腦內敲除JIP3會導致發(fā)育期的端腦連接缺失。JIP3還可以通過調控FAK影響癌細胞的運動能力。然而,作為JNK的支架蛋白,JIP3在皮層的發(fā)育過程中是否會參與神經(jīng)元的遷移還沒有研究過。在我們的研究中,我們利用胚胎宮內電轉干擾JIP3在即將分化為皮層神經(jīng)元的神經(jīng)前體細胞中的表達,從而證實了JIP3在皮層神經(jīng)元放射狀遷移過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn),干擾JIP3的表達之后可以破壞神經(jīng)元的遷移,進一步長時程觀察出生后的電轉小鼠證實JIP3對皮層神經(jīng)元放射狀遷移的影響是一種延緩的效應。最后,我們通過共轉siJIP3和JIP3不同結構域缺失突變體,研究JIP3調控神經(jīng)元放射狀遷移的關鍵功能域,以此研究調控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制。我們的結果顯示,JIP3介導kinesin轉運的KBD和LZ結構域對于神經(jīng)元遷移具有重要的作用。這些結果證實,在皮層發(fā)育過程中中JIP3對神經(jīng)元放射狀遷移發(fā)揮著重要的調控作用。目的：1.探討JIP3與大腦皮層發(fā)育的關系,進一步證實JIP3對于皮層神經(jīng)元放射狀遷移的作用。2.研究JIP3調控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制,為理解皮層發(fā)育提供新的理論。方法：1.蛋白印跡實驗將不同發(fā)育時期的小鼠皮層分離出來,用裂解液勻漿處理后提取蛋白樣品。蛋白樣在95℃煮5min,然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,將蛋白轉移至PVDF膜上。經(jīng)過抗體孵育、顯色之后分析結果。2.胚胎宮內電轉懷孕15.5天的孕鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,5-10min之后,將已麻醉的老鼠腹部向上放置在操作臺上。沿著腹部中線在腹部剪開外皮及內皮,開口2cm左右。將中部有橢圓形開口的紗布覆蓋在孕鼠腹部。用鑷子將胚胎拉出,將子宮左右兩側的胎鼠分別放置在紗布的左右兩側,用預熱的生理鹽水浸潤胚胎,防止其變干。將含有0.1% Fast Green、濃度為1.5ug/ul的質粒用微注射管注射到腦室中,用電極夾持住胎鼠頭部進行電轉。這個電轉過程要在40min之內完成,并將胚胎塞回子宮內,并將手術開口進行縫合。將手術完成的孕鼠放置在能維持體溫的環(huán)境中直至老鼠恢復意識。3.質粒構建JIP3小干擾RNA的序列插入到U6啟動子的下游,其靶向的序列是：CAGGCC GAG GAG AAA TTC A。干擾效率是在HEK-293細胞中分別電轉干擾質粒和對照質粒測定的。帶有EGFP標簽的JIP3-resistant質粒通過點突變的方式構建,突變的位點未改變原來氨基酸的序列。突變之后的序列是：CAaGCg GAa GAG AAg TTC A。用于胚胎宮內電轉的質粒是以pCAGIG-IRES-EGFP為載體。4.免疫組織化學取出的大腦在4%的多聚甲醛中固定,過夜后轉移至30%的蔗糖溶液中,直至腦沉至溶液底部表明組織以脫水完全。將大腦進行包埋冰凍處理后進行切片。切好的組織切片經(jīng)過抗體孵育之后進行顯微拍照,最終進行圖片處理及數(shù)據(jù)分析。結果：1.JIP3參與大腦皮層的發(fā)育1.1 JIP3在發(fā)育期和出生后的皮層表達譜JIP3在胚胎期和出生后都有較高的表達,在E13-E17和PO之后兩個時間段,JIP3的蛋白水平都有明顯的增加。1.2干擾JIP3的表達損害了皮層的六層層狀結構利用在端腦中條件性下調JIP3表達的轉基因小鼠,發(fā)現(xiàn)E19和成年的小鼠的大腦皮層的層狀結構都變得紊亂。而且成年小鼠的皮層厚度變薄。2.JIP3調節(jié)皮層神經(jīng)元的放射狀遷移2.1干擾JIP3不影響神經(jīng)前體細胞的增殖通過BrdU染色發(fā)現(xiàn),干擾了JIP3之后處于分裂的細胞數(shù)目沒有受到影響。2.2干擾JIP3的表達不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化狀態(tài)分析在IZ區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)現(xiàn),干擾JIP3之后對神經(jīng)元有多極向雙極轉化的過程沒有影響。2.3下調JIP3的表達損害了神經(jīng)元的遷移使用干擾效率達到90%的小干擾RNA,電轉到E15.5的胎鼠腦內。三天之后檢測神經(jīng)元的遷移情況發(fā)現(xiàn),干擾JIP3的表達之后,神經(jīng)元主要滯留在了IZ。3.JIP3通過延遲神經(jīng)元的遷移來調節(jié)皮層的發(fā)育。在E15.5進行胚胎電轉之后,在PO和P7取材,跟對照組相比發(fā)現(xiàn),干擾JIP3之后神經(jīng)元遷移到上層的細胞數(shù)目仍不能達到對照組水平,但是神經(jīng)元仍處在不斷遷移的過程中。4.JIP3調節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制我們共轉了JIP3-resistant和siJIP3兩種質粒,干擾JIP3引起的皮層神經(jīng)元放射狀遷移的缺陷得到了緩解。接下來,我們又將JIP3的不同結構域的缺失突變體分別與siJIP3共轉,發(fā)現(xiàn)JIP3介導kinesi n轉運貨物的KBD和LZ結構域對調控皮層神經(jīng)元放射狀遷移非常重要。結論：1.我們的研究得到JIP3在發(fā)育的皮層中的表達譜,在胚胎期缺失JIP3使皮層層狀結構發(fā)生紊亂。2.下調JIP3之后延遲了神經(jīng)元的遷移,而不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化和神經(jīng)前體細胞的增殖。3.JIP3結構域KBD和LZ對JIP3神經(jīng)元遷移至關重要。創(chuàng)新點：1.量化了JIP3在發(fā)育期以及出生后不同時間點的表達情況；2.干擾JIP3表達之后延緩了皮層神經(jīng)元放射狀遷移；3.JIP3參與轉運的功能域KBD、LZ對調控神經(jīng)元遷移至關重要。
【關鍵詞】：JIP3 大腦皮層 放射狀遷移 胚胎宮內電轉
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q427
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-38
• 實驗結果38-45
• 討論45-48
• 附圖48-52
• 參考文獻52-55
• 致謝55-57
• Publications57-58
• 學位論文評閱及答辯況58

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