發(fā)布時間：2017-09-14 23:03

  本文關(guān)鍵詞：JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的研究

  更多相關(guān)文章： JIP3 大腦皮層 放射狀遷移 胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)

【摘要】：背景大腦皮層是大腦中最大的結(jié)構(gòu),它由很多神經(jīng)元構(gòu)成。大腦皮層是大腦結(jié)構(gòu)中最為復(fù)雜的區(qū)域,發(fā)育完全的大腦皮層可以形成高度有序的六層層狀結(jié)構(gòu)。皮層形成的六層獨特結(jié)構(gòu)由不同形態(tài)及功能的細(xì)胞構(gòu)成,其對于皮層神經(jīng)環(huán)路形成、認(rèn)知功能、情感以及意識都具有重要的作用。因此,在發(fā)育過程中,新生的神經(jīng)元準(zhǔn)確的遷移到其最終的位置對于實現(xiàn)大腦的諸多功能是至關(guān)重要的,例如對于形成皮層精確的層狀結(jié)構(gòu)以及后續(xù)神經(jīng)環(huán)路的形成都是必不可少的。已有研究證實,皮層神經(jīng)元可以從室管膜區(qū)/室管膜下區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞分裂產(chǎn)生,然后沿著放射性膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行放射狀遷移,通過intermediate zone到達(dá)發(fā)育中的corticalplate。目前對于皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制研究,已有很多信號通路如reelin信號通路、JNK信號通路等被報道參與到神經(jīng)元的遷移,但具體參與調(diào)控的分子機制仍在繼續(xù)研究。JIP3是JNK信號通路的一個支架蛋白,它在成年的大腦中有高表達(dá)。在老鼠腦內(nèi)敲除JIP3會導(dǎo)致發(fā)育期的端腦連接缺失。JIP3還可以通過調(diào)控FAK影響癌細(xì)胞的運動能力。然而,作為JNK的支架蛋白,JIP3在皮層的發(fā)育過程中是否會參與神經(jīng)元的遷移還沒有研究過。在我們的研究中,我們利用胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)干擾JIP3在即將分化為皮層神經(jīng)元的神經(jīng)前體細(xì)胞中的表達(dá),從而證實了JIP3在皮層神經(jīng)元放射狀遷移過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn),干擾JIP3的表達(dá)之后可以破壞神經(jīng)元的遷移,進(jìn)一步長時程觀察出生后的電轉(zhuǎn)小鼠證實JIP3對皮層神經(jīng)元放射狀遷移的影響是一種延緩的效應(yīng)。最后,我們通過共轉(zhuǎn)siJIP3和JIP3不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體,研究JIP3調(diào)控神經(jīng)元放射狀遷移的關(guān)鍵功能域,以此研究調(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制。我們的結(jié)果顯示,JIP3介導(dǎo)kinesin轉(zhuǎn)運的KBD和LZ結(jié)構(gòu)域?qū)τ谏窠?jīng)元遷移具有重要的作用。這些結(jié)果證實,在皮層發(fā)育過程中中JIP3對神經(jīng)元放射狀遷移發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目的：1.探討JIP3與大腦皮層發(fā)育的關(guān)系,進(jìn)一步證實JIP3對于皮層神經(jīng)元放射狀遷移的作用。2.研究JIP3調(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制,為理解皮層發(fā)育提供新的理論。方法：1.蛋白印跡實驗將不同發(fā)育時期的小鼠皮層分離出來,用裂解液勻漿處理后提取蛋白樣品。蛋白樣在95℃煮5min,然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)過抗體孵育、顯色之后分析結(jié)果。2.胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)懷孕15.5天的孕鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,5-10min之后,將已麻醉的老鼠腹部向上放置在操作臺上。沿著腹部中線在腹部剪開外皮及內(nèi)皮,開口2cm左右。將中部有橢圓形開口的紗布覆蓋在孕鼠腹部。用鑷子將胚胎拉出,將子宮左右兩側(cè)的胎鼠分別放置在紗布的左右兩側(cè),用預(yù)熱的生理鹽水浸潤胚胎,防止其變干。將含有0.1% Fast Green、濃度為1.5ug/ul的質(zhì)粒用微注射管注射到腦室中,用電極夾持住胎鼠頭部進(jìn)行電轉(zhuǎn)。這個電轉(zhuǎn)過程要在40min之內(nèi)完成,并將胚胎塞回子宮內(nèi),并將手術(shù)開口進(jìn)行縫合。將手術(shù)完成的孕鼠放置在能維持體溫的環(huán)境中直至老鼠恢復(fù)意識。3.質(zhì)粒構(gòu)建JIP3小干擾RNA的序列插入到U6啟動子的下游,其靶向的序列是：CAGGCC GAG GAG AAA TTC A。干擾效率是在HEK-293細(xì)胞中分別電轉(zhuǎn)干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒測定的。帶有EGFP標(biāo)簽的JIP3-resistant質(zhì)粒通過點突變的方式構(gòu)建,突變的位點未改變原來氨基酸的序列。突變之后的序列是：CAaGCg GAa GAG AAg TTC A。用于胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒是以pCAGIG-IRES-EGFP為載體。4.免疫組織化學(xué)取出的大腦在4%的多聚甲醛中固定,過夜后轉(zhuǎn)移至30%的蔗糖溶液中,直至腦沉至溶液底部表明組織以脫水完全。將大腦進(jìn)行包埋冰凍處理后進(jìn)行切片。切好的組織切片經(jīng)過抗體孵育之后進(jìn)行顯微拍照,最終進(jìn)行圖片處理及數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：1.JIP3參與大腦皮層的發(fā)育1.1 JIP3在發(fā)育期和出生后的皮層表達(dá)譜JIP3在胚胎期和出生后都有較高的表達(dá),在E13-E17和PO之后兩個時間段,JIP3的蛋白水平都有明顯的增加。1.2干擾JIP3的表達(dá)損害了皮層的六層層狀結(jié)構(gòu)利用在端腦中條件性下調(diào)JIP3表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)E19和成年的小鼠的大腦皮層的層狀結(jié)構(gòu)都變得紊亂。而且成年小鼠的皮層厚度變薄。2.JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元的放射狀遷移2.1干擾JIP3不影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖通過BrdU染色發(fā)現(xiàn),干擾了JIP3之后處于分裂的細(xì)胞數(shù)目沒有受到影響。2.2干擾JIP3的表達(dá)不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化狀態(tài)分析在IZ區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)現(xiàn),干擾JIP3之后對神經(jīng)元有多極向雙極轉(zhuǎn)化的過程沒有影響。2.3下調(diào)JIP3的表達(dá)損害了神經(jīng)元的遷移使用干擾效率達(dá)到90%的小干擾RNA,電轉(zhuǎn)到E15.5的胎鼠腦內(nèi)。三天之后檢測神經(jīng)元的遷移情況發(fā)現(xiàn),干擾JIP3的表達(dá)之后,神經(jīng)元主要滯留在了IZ。3.JIP3通過延遲神經(jīng)元的遷移來調(diào)節(jié)皮層的發(fā)育。在E15.5進(jìn)行胚胎電轉(zhuǎn)之后,在PO和P7取材,跟對照組相比發(fā)現(xiàn),干擾JIP3之后神經(jīng)元遷移到上層的細(xì)胞數(shù)目仍不能達(dá)到對照組水平,但是神經(jīng)元仍處在不斷遷移的過程中。4.JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制我們共轉(zhuǎn)了JIP3-resistant和siJIP3兩種質(zhì)粒,干擾JIP3引起的皮層神經(jīng)元放射狀遷移的缺陷得到了緩解。接下來,我們又將JIP3的不同結(jié)構(gòu)域的缺失突變體分別與siJIP3共轉(zhuǎn),發(fā)現(xiàn)JIP3介導(dǎo)kinesi n轉(zhuǎn)運貨物的KBD和LZ結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移非常重要。結(jié)論：1.我們的研究得到JIP3在發(fā)育的皮層中的表達(dá)譜,在胚胎期缺失JIP3使皮層層狀結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。2.下調(diào)JIP3之后延遲了神經(jīng)元的遷移,而不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。3.JIP3結(jié)構(gòu)域KBD和LZ對JIP3神經(jīng)元遷移至關(guān)重要。創(chuàng)新點：1.量化了JIP3在發(fā)育期以及出生后不同時間點的表達(dá)情況；2.干擾JIP3表達(dá)之后延緩了皮層神經(jīng)元放射狀遷移；3.JIP3參與轉(zhuǎn)運的功能域KBD、LZ對調(diào)控神經(jīng)元遷移至關(guān)重要。
【關(guān)鍵詞】：JIP3 大腦皮層 放射狀遷移 胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q427
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-38
• 實驗結(jié)果38-45
• 討論45-48
• 附圖48-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 致謝55-57
• Publications57-58
• 學(xué)位論文評閱及答辯況58

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