本文關(guān)鍵詞：孕期炎癥刺激對子代小鼠體重的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：肥胖是很多慢性疾病(高血壓、糖尿病等)的誘因和基礎(chǔ),對全球人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。目前,對肥胖成因的研究大多歸結(jié)于遺傳因素、不良的飲食習(xí)慣以及缺乏身體活動,治療也主要是針對肥胖或/和有肥胖先兆的人體/動物進(jìn)行。但在人們普遍注意健康生活方式的今天,其發(fā)病率仍逐年迅猛增加,提示有其他新的重要致病機(jī)制存在。在對低出生體重兒和宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒的研究中發(fā)現(xiàn)成年后出現(xiàn)肥胖及代謝綜合征的幾率是正常兒童的5.75倍,提示胎兒的宮內(nèi)發(fā)育是影響成年后肥胖的獨(dú)立因素。因此,著眼于生命早期,研究探討肥胖/超重發(fā)病的新病因,對肥胖及其相關(guān)代謝疾病的防治具有重大意義。本室前期研究發(fā)現(xiàn),母體孕期炎癥刺激能導(dǎo)致子代發(fā)生高血壓并伴有體重明顯增加[1,2]。同時,肥胖及其相關(guān)代謝綜合征又與高血壓的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)[3]。mi RNAs是長度約為23個核苷酸且具有m RNA調(diào)控功能的單鏈非編碼RNA,它在轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控中起著重要作用。多個高通量研究表明一些mi RNAs在代謝性疾病中差異表達(dá),相關(guān)mi RNAs在糖尿病和高脂模型中的調(diào)控作用已被報(bào)道[4,5],對mi RNAs在疾病中調(diào)控作用的研究受到廣泛關(guān)注。本室前期成功創(chuàng)建的孕期炎癥刺激致子代動物高血壓和肥胖模型,為本課題的開展奠定了良好的基礎(chǔ)。但是,孕期炎癥刺激子代小鼠肥胖的類型、對子代脂肪發(fā)育的影響、mi RNAs的變化,以及mi RNAs變化與子代脂肪發(fā)育改變的關(guān)系等科學(xué)問題均有待闡明。為此,本文即對上述幾個問題進(jìn)行了初步研究,以期為深化對肥胖及相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識提供新思路,并為尋找新的防治分子靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.孕期炎癥刺激對子代小鼠體重及部分代謝指標(biāo)的影響的研究方法1.1 8w齡C57小鼠,雌:雄=2:1的比例同籠過夜,第二天7:00前觀察陰栓,確定孕鼠。1.2孕11d給予孕鼠一次性腹腔注射脂多糖(LPS)(75μg/kg),對照組注射0.2ml的生理鹽水。分別于子鼠4w、8w、12w取材。1.3兩組子鼠從出生開始進(jìn)行體重監(jiān)測,每2w測量一次體重(g)和體長(cm),直到12w。并計(jì)算對應(yīng)Lee’s指數(shù)(Lee’s指數(shù)=[體重(g)×103/體長(cm)]1/3)。1.4子鼠4w、8w和12w時,斷頸處死。取雌鼠腎周脂肪、雄鼠附睪脂肪,稱重并計(jì)算脂肪系數(shù)(脂肪系數(shù)=脂肪濕重/體重×100)。1.5對4w、8w、12w的子鼠,麻醉后進(jìn)行Micro-CT檢測,利用Mimics10.01分析皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪分布情況。1.6子鼠4w、8w和12w取血清,檢測血總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)含量。1.7對4w、8w及12w的子鼠禁食12h后檢測空腹血糖。然后,灌服2.5g/kg的20%的葡萄糖溶液,分別于灌服后0.5h、1h、2h及3h檢測血糖。2.孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機(jī)制研究的研究方法2.1取4w、8w、12w子鼠內(nèi)臟脂肪組織。采用常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行HE染色。在40×顯微鏡下,隨機(jī)選取8-10個視野進(jìn)行觀察檢測,并統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞直徑大小(μm)。2.2 Real-time PCR法檢測4w、8w、12w子鼠脂肪組織中脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物的基因表達(dá)水平。(CEBP/α、CEBP/β、CEBP/δ、a P2、PPARγ)2.3 Real-time PCR法檢測4w、8w、12w子鼠脂肪中mi R-143、mi R-320、mi R-375、mi R-126、mi R-218、mi R-16、mi R-224、mi R-423、mi R-200a、mi R-200b、mi R-200c、mi R-145、mi R-214、mi R-351、mi R-30c、mi R-30d、mi R-30e、mi R-199a、mi R-23b、mi R-290的表達(dá)水平。2.4 Real-time PCR法檢測mi R-224、mi R-200b、mi R-30d在子鼠附睪脂肪組織的脂肪間質(zhì)血管成分(SVF)及成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。2.5 Real-time PCR法檢測mi R-224、mi R-200b、mi R-30d在子鼠附睪脂肪SVF部分各個亞型中的表達(dá)水平。2.6用MTT法、Ed U法分別檢測mi R-200b、mi R-224、mi R-30d對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響。2.7油紅O染色觀測3T3-L1分化情況,Real-time PCR法檢測每組中脂肪分化標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果:1.母體孕期炎癥刺激對子代小鼠體重及部分代謝指標(biāo)的影響1.1與NS組相比,LPS組4w雌鼠體重顯著升高(p0.05),雄鼠體重增加非常顯著(p0.01);6w~12w,雌鼠及雄鼠體重均顯著升高(p0.01)。與NS組相比,4w LPS組雌鼠Lee’s指數(shù)顯著增高(p0.05);雄鼠升高非常顯著(p0.01);6w~12w,雌雄鼠Lee’s指數(shù)均顯著升高(p0.01)。1.2 4w時,LPS組子代雄鼠附睪脂肪濕重顯著高于NS組(p0.05),附睪脂肪系數(shù)有升高趨勢但無顯著性差異。8w和12w LPS組子代小鼠肪濕重和脂肪系數(shù)均顯著高于NS組(p0.05)。1.3 micro-CT結(jié)果顯示,4w、8w和12w子代雌/雄性小鼠,LPS組內(nèi)臟脂肪顯著高于NS組(p0.01)。而皮下脂肪的變化并無顯著性差異(p0.05)。1.4與NS組相比,4w/8w/12w LPS組子代小鼠空腹血糖無顯著性差異,但在口服糖耐量實(shí)驗(yàn)中,LPS組子鼠的血糖應(yīng)答曲線下面積(AUC)顯著高于NS組(p0.01),表現(xiàn)出糖耐量不良。1.5與NS相比,LPS組4w雌鼠血清TC、LDL顯著升高(p0.05),雄鼠血清TC、TG、LDL和HDL顯著升高(p0.05);8w雌鼠血清TC和HDL顯著升高(p0.05),雄鼠血清TG、TC和HDL顯著升高(p0.05);12w雌鼠血清TC和HDL顯著降低(p0.05),雄鼠血清TC、TG、HDL和LDL顯著性升高(p0.05)。LPS組子代小鼠表現(xiàn)出血脂異常。2.孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機(jī)制研究2.1與NS組相比,LPS組4w子代小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)無明顯變化(雌鼠腎周脂肪細(xì)胞,雄鼠附睪脂肪細(xì)胞);8w子代小鼠脂肪細(xì)胞直徑顯著增大(p0.05);12w子代小鼠脂肪細(xì)胞直徑增大非常顯著(p0.01)。2.2與NS組相比,LPS組4w子鼠脂肪分化標(biāo)志物a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β和CEBP/δ的表達(dá)均無顯著性差異(p0.05);8w子鼠脂肪組織中CEBP/δ表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05),a P2、PPARγ和CEBP/α表達(dá)上調(diào)非常顯著(p0.01),CEBP/β表達(dá)無明顯變化;12w子鼠脂肪中a P2、PPARγ、CEBP/α和CEBP/δ表達(dá)顯著性上調(diào)(p0.01),CEBP/β表達(dá)無明顯變化。2.3與NS組相比,LPS組4w子鼠脂肪組織中1個mi RNAs(mi R-199a)顯著性上調(diào)(p0.05),8個mi RNAs顯著性下調(diào)(p0.05);8w子鼠脂肪組織中包括mi R-199a等17個mi RNAs顯著性下調(diào)(p0.01);12w子鼠脂肪組織中17個mi RNAs顯著性下調(diào)(p0.01),其中15個與8w變化一致,另有mi R-30d、mi R-30e顯著性下調(diào)表達(dá)。2.4根據(jù)mi RNAs的差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)分析,選擇mi R-200b、mi R-224和mi R-30d為研究對象。與NS組相比,mi R-200b、mi R-224和mi R-30d在LPS組子鼠脂肪的成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)無明顯變化;但在LPS組子鼠脂肪基質(zhì)血管成分(SVF)部分的表達(dá)顯著降低(p0.05)。2.5利用流式細(xì)胞術(shù)分選出SVF部分各細(xì)胞亞型:內(nèi)皮細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞/脂肪間質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。與NS組相比,mi R-224在LPS組前脂肪細(xì)胞/脂肪間質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(p0.05),而在其他細(xì)胞亞型的表達(dá)無顯著差異;mi R-224、mi R-30d在各細(xì)胞亞型的表達(dá)均無顯著性差異。另外,LPS組SVF中巨噬細(xì)胞比例明顯升高。2.6選擇前脂肪細(xì)胞3T3-L1為研究對象。發(fā)現(xiàn)僅mi R-200b有顯著性抑制前脂肪細(xì)胞增殖的作用(p0.05),而anti-mi R200b有促進(jìn)增殖的趨勢。2.7與陰性對照相比,僅anti-mi R224有顯著性促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的作用;而mi R-224有抑制前脂肪細(xì)胞分化的趨勢。其他組別未見明顯作用。結(jié)論:1.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠體重增加是以內(nèi)臟脂肪增加為特征的中心性肥胖,并出現(xiàn)血脂異常和糖耐量下降。2.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠出現(xiàn)脂肪發(fā)育異常變化。3.mi R-200b有抑制前脂肪細(xì)胞增殖的作用,anti-mi R224有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化的作用。mi R-224在子代小鼠脂肪原代前脂肪細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。4.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠肥胖的機(jī)制可能與脂肪發(fā)育異常及mi RNAs表達(dá)變化有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：孕期炎癥 中心性肥胖 mi RNAs
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 孕期炎癥刺激對子代小鼠體重及部分代謝指標(biāo)的影響16-34
• 2.1 材料與方法16-19
• 2.2 結(jié)果19-31
• 2.3 討論31-34
• 第三章 孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機(jī)制研究34-88
• 3.1 材料與方法34-51
• 3.2 結(jié)果51-84
• 3.3 討論84-88
• 全文結(jié)論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-93
• 文獻(xiàn)綜述Micro RNAs與脂肪形成及肥胖治療93-107
• 參考文獻(xiàn)103-107
• 碩士在讀期間發(fā)表文章107-108
• 致謝108

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本文編號：851172