發(fā)布時(shí)間：2017-09-12 03:21

  本文關(guān)鍵詞：不同亞型的NA基因在H5亞型禽流感滅活疫苗中的作用探討

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【摘要】：H5亞型禽流感是一種高致病性禽流感,感染性強(qiáng),致死率高。我國(guó)歷史上暴發(fā)的H5亞型禽流感大多是H5N1亞型,然而近兩年,H5N2、H5N8、H5N6、H5N5等亞型的疫情顯著增多。AIV抗原變異快,容易產(chǎn)生新亞型或新的變異株,給禽流感疫情的防控帶來了巨大的困難,研制能有效防控H5亞型禽流感的疫苗,是防控H5亞型流感疫情重要途徑。為了探討不同亞型的NA基因在H5亞型禽流感滅活疫苗中的作用,本研究選取了三株攻毒毒株和三株制苗毒株進(jìn)行研究。本研究中所涉及毒株均是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)教研室張?jiān)钤麓T士通過反向遺傳技術(shù)重組所得。攻毒毒株SH7,rSH7-674NA和rSH7-LZFNA是以A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1)為骨架,NA基因分別來源于毒株A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1),A/Goose/Guangdong/Y674/2014(H5N6),A/Chicken/Hebei/LZF/2013(H5N2)。制苗毒株SH7dHA,SH7dHA674NA和SH7dHALZFNA是以A/Chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)為骨架,HA基因?qū)ザ径局闔A的堿性裂解位點(diǎn)進(jìn)行修飾降低其毒力所得,NA基因分別來源于毒株A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1),A/Goose/Guangdong/Y674/2014(H5N6),A/Chicken/Hebei/LZF/2013(H5N2)。分別在SPF雞和SPF級(jí)BALB/c小鼠動(dòng)物模型上進(jìn)行交叉免疫保護(hù)試驗(yàn),研究?jī)?nèi)容如下:在SPF雞模型上,將100只SPF雞分為四大組,按0.5mL/只的劑量采用胸部肌肉注射分別免疫疫苗SH7dHA,SH7dHA674NA和SH7dHALZFNA,對(duì)照組免疫同等劑量PBS。免疫3周后采血進(jìn)行HA-HI交叉試驗(yàn)和雞胚中和試驗(yàn)。然后將各大組分為三小組,通過點(diǎn)眼滴鼻分別感染稀釋成105EID50的三株攻毒毒株,0.2mL/只,連續(xù)觀察14d。感染后于第2d、4d、6d采集拭子檢測(cè)排毒情況。感染第4d每組隨機(jī)采集3只雞的臟器檢測(cè)病毒感染情況,剩余雞在感染第14d采血測(cè)HI效價(jià)。結(jié)果顯示:a、雞免疫后HI交叉效價(jià)明顯上升在8.52log2~10.52log2范圍內(nèi),感染第14d后HI交叉效價(jià)仍處于較高水平在7.85log2~9.92log2范圍內(nèi)。雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,三組免疫血清對(duì)毒株SH7和rSH7-LZFNA的抗體效價(jià)較高在246~544范圍內(nèi),對(duì)毒株rSH7-674NA的抗體效價(jià)較低在15~30范圍內(nèi)。b、拭子檢測(cè)結(jié)果顯示各組感染后第2d排毒率,第4d和第6d排毒率較低,rsh7-674na/sh7dha674na組第6d排毒率仍較高。對(duì)照組肺臟病毒滴度較高,log10eid50/0.2ml值在6.35~7.2范圍內(nèi),其余臟器均能檢測(cè)到病毒;免疫攻毒組肺臟病毒滴度較低,log10eid50/0.2ml值在1.75~3.75范圍內(nèi),其余臟器病毒的檢出率低。c、對(duì)照組感染3d內(nèi)全部死亡,第5drsh7-674na/sh7dhalzfna組死亡1只,第7drsh7-674na/sh7dha674na組死亡2只,其余各組未出現(xiàn)死亡。在spf級(jí)balb/c小鼠模型上,將144只小鼠分為四大組,采用肌內(nèi)注射100μl/只+皮下注射100μl/只分別免疫疫苗sh7dha,sh7dha674na和sh7dhalzfna,對(duì)照組免疫同等劑量pbs,14d后二免。4周后采血進(jìn)行ha-hi交叉試驗(yàn)和血清總igg檢測(cè)。然后將各免疫組分為三小組,將稀釋成100ld50的三株攻毒毒株以50μl/只的劑量分別經(jīng)鼻腔感染小鼠(用干冰輕微麻醉后),對(duì)照組滴注pbs,連續(xù)觀察14d,每日稱重。感染后第4d每組分別剖殺3只小鼠,采血測(cè)igg含量并取鼻甲骨、肺臟、腦檢測(cè)病毒滴度,剩余小鼠于第14d采血測(cè)igg含量。結(jié)果顯示:a、小鼠免疫后hi交叉效價(jià)顯著上升在6.75log2~8.4log2范圍內(nèi),血清中總igg含量顯著上升平均在50294.7ng/ml~71066.9ng/ml范圍內(nèi)。b、對(duì)照組分別于第9d和第11d全部死亡,其余各組均未死亡。感染后對(duì)照組小鼠體重先升后降,各免疫組感染sh7和rsh7-674na體重呈先降后升的緩慢波動(dòng),感染rsh7-lzfna體重呈平緩上升趨勢(shì)。c、對(duì)照組鼻甲骨病毒滴度log10eid50/0.2ml值在1.5~2.33范圍內(nèi),肺臟病毒滴度log10eid50/0.2ml值在2.88~5.5范圍內(nèi)。在鼻甲骨和肺臟中,rsh7-674na/sh7dhalzfna組的病毒滴度均高于rsh7-674na/sh7dha組,其余各免疫組均未在鼻甲骨和肺中檢測(cè)到病毒。d、感染后第4digg含量平均在42398ng/ml~128170ng/ml范圍內(nèi),第14digg含量均在52124ng/ml以上。綜上所述,在spf雞模型上三株自制的h5滅活疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的hi效價(jià),均能對(duì)三株不同na亞型的h5禽流感起到較好的交叉免疫保護(hù)作用,不同亞型的na基因?qū)5亞型禽流感滅活疫苗的免疫效果差異不顯著。在balb/c小鼠模型上,三株自制的h5滅活疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的hi效價(jià)和血清總igg,均能對(duì)三株不同na亞型的h5禽流感起到較好的交叉免疫保護(hù)作用。對(duì)于相同ha基因的h5亞型禽流感,n1亞型的疫苗對(duì)n6亞型的aiv的保護(hù)力比N2亞型的疫苗對(duì)N6亞型的AIV的保護(hù)力相對(duì)更強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：H5亞型禽流感 疫苗 流行毒株 交叉免疫
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文縮略表9-13
• 1 前言13-18
• 1.1 禽流感概述13
• 1.2 禽流感病毒分子生物學(xué)13-15
• 1.2.1 禽流感病毒的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.2 禽流感基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能14-15
• 1.3 禽流感滅活疫苗以及基于NA的疫苗研究15-16
• 1.3.1 禽流感滅活疫苗15-16
• 1.3.2 基于NA蛋白疫苗研究16
• 1.4 H5亞型禽流感最近流行情況16-17
• 1.5 重組流感病毒滅活疫苗17-18
• 1.6 本研究的目的和意義18
• 2 材料與方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 相關(guān)試劑18-19
• 2.1.2 雞胚和試驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.1.3 引物19-20
• 2.1.4 主要儀器20
• 2.1.5 生物學(xué)軟件20
• 2.1.6 攻毒毒株20-21
• 2.1.7 制苗毒株21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 病毒的純化與增殖21
• 2.2.2 流感病毒的鑒定及遺傳演化分析21-23
• 2.2.3 疫苗的制備23
• 2.2.4 病毒對(duì)SPF雞免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)23-25
• 2.2.5 病毒對(duì)SPF級(jí)BALB/c小鼠免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)25-27
• 3 結(jié)果與分析27-47
• 3.1 流感病毒HA和NA基因的鑒定及遺傳演化分析27-31
• 3.1.1 HA基因序列分析27-29
• 3.1.2 NA基因序列分析29-31
• 3.2 病毒對(duì)SPF雞免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)31-39
• 3.2.1 病毒對(duì)雞胚半數(shù)感染量（EID50）31
• 3.2.2 雞免疫血清HI雙交叉中和效價(jià)31-32
• 3.2.3 抗原性差異系數(shù)R值分析32
• 3.2.4 雞免疫血清雞胚中和效價(jià)32-33
• 3.2.5 SPF雞感染后存活率33-35
• 3.2.6 SPF雞感染后臟器病毒量35-37
• 3.2.7 SPF雞感染后咽/肛拭子病毒檢測(cè)37-39
• 3.2.8 SPF雞感染 14d血清HI雙交叉中和效價(jià)39
• 3.3 病毒對(duì)SPF BALB/c小鼠免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)39-47
• 3.3.1 病毒對(duì)SPF BALB/c小鼠LD5039-40
• 3.3.2 BALB/c小鼠免疫血清HI雙交叉中和效價(jià)40
• 3.3.3 抗原性差異系數(shù)R值分析40-41
• 3.3.4 BALB/c小鼠感染前血清總Ig G41
• 3.3.5 BALB/c小鼠感染后體重變化41-43
• 3.3.6 BALB/c小鼠感染后存活率43-44
• 3.3.7 BALB/c小鼠感染后臟器病毒量44-46
• 3.3.8 BALB/c小鼠感染后 4d血清總Ig G46-47
• 3.3.9 BALB/c小鼠感染后 14d血清總Ig G47
• 4 討論47-50
• 5 全文總結(jié)50-51
• 致謝51-53
• 參考文獻(xiàn)53-55

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