本文關(guān)鍵詞：靶向調(diào)控大鼠海馬CNN3基因表達(dá)對(duì)癲癇易感性的影響研究

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【摘要】：[目的]Calponin-3是調(diào)節(jié)興奮性突觸后膜樹突棘的動(dòng)力蛋白,課題組前期研究提示癲癇患者及動(dòng)物腦組織和腦脊液中的CNN3基因及其調(diào)控蛋白calponin-3均顯著升高,但確切機(jī)制不清。若能探明神經(jīng)元calponin-3表達(dá)改變與癇性發(fā)作間的因果關(guān)系,揭示其中相關(guān)的環(huán)節(jié),可豐富我們對(duì)慢性癲癇腦內(nèi)生化改變的認(rèn)識(shí)、深化對(duì)耐藥性癲癇的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),為開發(fā)新藥物開辟新途徑。[方法]首先針對(duì)大鼠CNN3基因序列設(shè)計(jì)并鑒定能夠靶向干擾和過表達(dá)CNN3的慢病毒載體；將包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒立體定向注射入大鼠海馬即體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠海馬,通過western blot試驗(yàn)檢測干擾和過表達(dá)CNN3基因的效果。動(dòng)態(tài)觀察8周后,確定干擾和上調(diào)calponin-3表達(dá)的最佳序列和時(shí)間點(diǎn),分別給對(duì)照組、CNN3干擾(CNN3-shRNA)組、CNN3過表達(dá)(CNN3-OE)組實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射氯化鋰和匹魯卡品進(jìn)行癲癇點(diǎn)燃試驗(yàn)。再通過腦電圖監(jiān)測及行為學(xué)觀察各組癲癇發(fā)生的潛伏期、持續(xù)時(shí)長、嚴(yán)重程度以及癲癇點(diǎn)燃的成功率來評(píng)估各組大鼠的癲癇易感性。最后在點(diǎn)燃成功后不同時(shí)間點(diǎn),采用免疫印跡(western blot)實(shí)驗(yàn)定量癲癇發(fā)作后對(duì)照組、CNN3-shRNA組和CNN3-OE組實(shí)驗(yàn)鼠腦內(nèi)calponin-3的變化情況,用膜片鉗技術(shù)記錄癲癇鼠海馬區(qū)場電位及全細(xì)胞電位。[結(jié)果]成功構(gòu)建了CNN3-OE和3個(gè)CNN3-shRNA慢病毒干擾載體,轉(zhuǎn)染后8周內(nèi)對(duì)海馬CNN3基因水平均有一定調(diào)控作用,其中CNN3-shRNA2載體組在轉(zhuǎn)染后的8周內(nèi)海馬CNN3基因編碼蛋白calponin-3水平均顯著性下調(diào),最高抑制率為73.26%；CNN3-OE慢病毒載體組中海馬calponin-3蛋白水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高僅在轉(zhuǎn)染后第14天,上調(diào)率為93.88%。選擇CNN3-shRNA2載體和CNN3-OE以及它們對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組立體定向轉(zhuǎn)染大鼠海馬,在改變calponin-3蛋白表達(dá)水平最高的時(shí)間點(diǎn)與正常大鼠同時(shí)進(jìn)行癲癇點(diǎn)燃,腦電圖監(jiān)測結(jié)果顯示各組大鼠均可記錄到癲癇樣腦電活動(dòng),表明癲癇模型構(gòu)建成功。行為學(xué)研究顯示：CNN3-OE組癲癇發(fā)作的潛伏期為(29.17±19.08)min, CNN3-shRNA2的潛伏期為(40.717±28.40) min, CNN3-shRNA2組癲癇發(fā)作的潛伏期顯著長于CNN3-OE組,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但改變calponin-3蛋白水平后,各組實(shí)驗(yàn)鼠誘導(dǎo)癲癇發(fā)作所需匹羅卡品劑量、癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度均無顯著性差異。點(diǎn)燃成功后的大鼠在癲癇發(fā)作1小時(shí)后麻醉下迅速取腦片,膜片鉗記錄海馬區(qū)場電位及全細(xì)胞電位均未記錄到癲癇樣放電。CNN3-shRNA2組大鼠點(diǎn)燃后的48H內(nèi)calponin-3仍能保持在干預(yù)后的較低水平,僅在點(diǎn)燃后1w時(shí)升高,遠(yuǎn)期未出現(xiàn)calponin-3的明顯升高；CNN3-0E組大鼠點(diǎn)燃后48H內(nèi)calponin-3仍處于干預(yù)后較高的水平,在48H時(shí)出現(xiàn)明顯的升高,且升高趨勢持續(xù)到8W。[結(jié)論]本研究成功構(gòu)建了上調(diào)和沉默CNN3基因表達(dá)的慢病毒載體,篩選出最佳的shRNA序列為shRNA2-1: 5'-gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCTTTTTTg-3', shRNA2-2: 5'-aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAACTTTATAAGTTCTCTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCg-----3',并經(jīng)定位注射實(shí)現(xiàn)在體調(diào)控局部腦區(qū)CNN3基因表達(dá),使大鼠海馬calponin-3蛋白表達(dá)水平顯著下降/上調(diào)50%以上,且這種高效的干擾效應(yīng)一直持續(xù)到第8周,表明該技術(shù)可用于動(dòng)物模型的基因功能研究,這將對(duì)闡明CNN3基因功能、深入了解突觸重塑和癲癇發(fā)病機(jī)制及開辟新的治療途徑等具有重要意義。通過進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)慕档蚦alponin-3的表達(dá)水平后實(shí)驗(yàn)鼠點(diǎn)燃誘發(fā)癲癇發(fā)作的閾值升高,這表明calponin-3的過表達(dá)與癲癇的發(fā)生有關(guān),抑制calponin-3表達(dá)可降低癲癇易感性,可能具有抗癲癇效應(yīng),為開發(fā)新型抗癲癇藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CNN3 慢病毒 耐藥性癲癇 沉默 過表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.1
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-35
• 結(jié)果35-47
• 討論47-51
• 結(jié)論51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述56-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果65-66
• 致謝66-67

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本文編號(hào)：788138