本文關(guān)鍵詞：Ucf-101對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：背景及目的癲癇(epilepsy,EP)是神經(jīng)內(nèi)科最常見的慢性腦部疾病之一。癲癇發(fā)作嚴(yán)重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量,也給社會帶來了重大的負(fù)面影響。動物模型和臨床研究已經(jīng)表明,長時(shí)間的癲癇發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)可造成腦部多個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元凋亡,其中海馬神經(jīng)細(xì)胞受損最為明顯。Omi/Htr A2(high-temperature requirement serine protease A2)是一種線粒體絲氨酸蛋白酶,屬于促凋亡因子,可通過半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteiny aspartate specific protease,caspase)依賴途徑或者非caspase依賴途徑參與細(xì)胞凋亡。在正常的生理情況下,成熟的Omi/Htr A2主要儲存于線粒體內(nèi)、外膜之間的膜間隙中。有研究表明,當(dāng)細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),凋亡誘導(dǎo)因子作用于線粒體,使線粒體外膜通透性增加,Omi/Htr A2進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),結(jié)合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAPs),并使其裂解,從而解除IAPs對caspase-3、7、9的抑制,激活caspase級聯(lián)放大反應(yīng),引起細(xì)胞凋亡。同時(shí),各種凋亡刺激作用于細(xì)胞時(shí),Omi/Htr A2通過其蛋白水解活性,可降解或清除線粒體抗凋亡蛋白(HIS-associated protein X-1,HAX-1),激活不依賴caspase的細(xì)胞凋亡途徑。Omi/Htr A2絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑(undetermined certain factor,Ucf-101)是Omi/Htr A2的特異性抑制劑,它通過抑制其活性,阻斷Omi/Htr A2的caspase和非caspase依賴凋亡途徑,從而發(fā)揮抑制凋亡的作用。已有研究表明,Ucf-101對心、肺、腎等器官的細(xì)胞具有保護(hù)作用,而且可減少腦缺血-再灌注及神經(jīng)退行性病變所引起的神經(jīng)元凋亡,但其對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的作用目前國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過建立氯化鋰-匹魯卡品(Lithium-pilocarpine,PILO)誘導(dǎo)SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)模型,采用HE、Nissl、TUNEL及免疫組化染色法檢測海馬組織損傷及細(xì)胞凋亡情況,觀察Ucf-101對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響,并通過檢測神經(jīng)元中Omi/Htr A2、caspase9及HAX-1表達(dá)水平的變化,來初步探討其中的可能機(jī)制。材料與方法160只健康雄性SD大鼠,6-8周,體重200-250g,隨機(jī)分為CON組、PILO組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和PILO+Ucf-101高劑量組,PILO組包括2h組、6h組、12h組、24h亞組,每組各20只。所有SD大鼠均行腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)預(yù)處理。20h后對PILO組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101組進(jìn)行腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)處理,為了拮抗匹魯卡品的外周膽堿能作用,在此之前的30min需要皮下注射氫溴酸東莨菪堿(1mg/kg)。并且在注射匹魯卡品前10min,PILO+Ucf-101低劑量組和PILO+Ucf-101高劑量組需要分別腹腔注射Ucf-101 0.7umol/kg和1.5umol/kg,PILO+DMSO組用等體積的DMSO代替Ucf-101。CON組腹腔注射等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。根據(jù)Racine癇性發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到Ⅳ或Ⅴ級為造模成功。SE持續(xù)60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止發(fā)作。記錄各組大鼠致癇成功率、存活率及發(fā)作潛伏期。取CON組、PILO 24h亞組、PILO+DMSO組及PILO+Ucf-101組造模成功且存活的大鼠總數(shù)的一半麻醉后灌注取腦,采用HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及免疫組化染色法檢測海馬神經(jīng)元損傷及凋亡情況;剩余大鼠麻醉后取出雙側(cè)海馬,采用Western blot法檢測Omi/Htr A2、caspase9及HAX-1表達(dá)變化。結(jié)果1行為學(xué)觀察:CON組SD大鼠無癲癇發(fā)作,PILO組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101組大鼠出現(xiàn)不同形式的癲癇發(fā)作。各組大鼠癲癇成功率及發(fā)作潛伏期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 HE染色結(jié)果:與CON組相比較,PILO 24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PILO+DMSO組較PILO 24h亞組神經(jīng)元數(shù)量減少,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PILO+Ucf-101組海馬神經(jīng)元數(shù)目多于PILO 24h亞組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目多于PILO+Ucf-101低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 Nissl染色結(jié)果:與CON組相比,PILO 24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目減少(P0.05)。PILO+DMSO組較PILO 24h亞組神經(jīng)元數(shù)量減少,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與PILO 24h亞組相比較,PILO+Ucf-101組海馬神經(jīng)元數(shù)目均增多(P0.05)。PILO+Ucf-101高劑量組較PILO+Ucf-101低劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目增多(P0.05)。4 TUNEL染色結(jié)果:PILO 24h亞組、PILO+DMSO組和PILO+Ucf-101組TUNEL陽性細(xì)胞多于CON組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);PILO+DMSO組較PILO 24h亞組陽性細(xì)胞數(shù)目增多,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與PILO 24h亞組相比,PILO+Ucf-101組海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與PILO+Ucf-101低劑量組比較,PILO+Ucf-101高劑量組海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5免疫組化染色結(jié)果:與CON組相比,PILO 24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)增高(P0.05),與PILO 24h亞組相比,PILO+Ucf-101組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)減少(P0.05),且PILO+Ucf-101低劑量組少于PILO+Ucf-101高劑量組(P0.05)。與CON組相比,PILO 24h亞組、PILO+DMSO組HAX-1表達(dá)減少(P0.05),與PILO 24h亞組相比,PILO+Ucf-101組HAX-1表達(dá)增多(P0.05),且PILO+Ucf-101高劑量組較PILO+Ucf-101低劑量組表達(dá)增高(P0.05)。PILO+DMSO組較PILO 24h亞組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)升高(P0.05),HAX-1表達(dá)降低,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 Western blot結(jié)果:與CON組相比,PILO組Omi/Htr A2、caspase9 2h開始升高(p0.05),24h達(dá)高峰(P0.05);HAX-1 2h開始升高(P0.05),6小時(shí)達(dá)峰(P0.05),然后下降,12h、24h均低于CON組(P0.05)。與PILO 24h亞組比較,PILO+Ucf-101組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)降低(P0.05),HAX-1升高(P0.05);與PILO+Ucf-101低劑量組比較,PILO+Ucf-101高劑量組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)降低(P0.05),HAX-1升高(P0.05)。PILO+DMSO組較PILO24h亞組Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)升高(P0.05),HAX-1表達(dá)降低,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1癲癇發(fā)作后24h內(nèi)Omi/Htr A2、caspase9表達(dá)持續(xù)增高,HAX-1表達(dá)早期增高,6h后降低,證實(shí)癲癇發(fā)作可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。2 Ucf-101可減少致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡,對癲癇后腦損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制與抑制Omi/Htr A2和caspase9表達(dá),增加HAX-1表達(dá)相關(guān)。3 Ucf-101的神經(jīng)保護(hù)作用具有劑量依賴性。
【關(guān)鍵詞】：癲癇 細(xì)胞凋亡 腦損傷 Ucf-101 Omi/HtrA2 神經(jīng)保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞對照表14-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-31
• 結(jié)果31-36
• 討論36-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 附圖46-51
• 綜述 癲癇與細(xì)胞凋亡51-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 個(gè)人簡歷、研究生期間撰寫的論文66-67
• 致謝67

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本文編號：787883