發(fā)布時間：2017-09-02 08:17

  本文關鍵詞：離體肝細胞Hsa-miR-660基因表達調(diào)控對CYP3A4蛋白表達的影響

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【摘要】：背景及目的 芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥物,鎮(zhèn)痛作用好,是嗎啡鎮(zhèn)痛作用的50-100倍,廣泛應用于臨床麻醉以及癌癥病人的鎮(zhèn)痛治療中。臨床工作中發(fā)現(xiàn),不同患者使用同等劑量的芬太尼產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果和副作用明顯不同。芬太尼主要通過肝臟中CYP3A4酶進行代謝成為幾乎沒有活性的去甲基芬太尼,研究發(fā)現(xiàn),不同患者的CYP3A4酶活性差異性很大,而基因多態(tài)性是影響CYP3A4酶活性的主要因素[1,2]。近年來,人們研究發(fā)現(xiàn)一種小分子單鏈RNA(miRNA)可以作用于基因的轉(zhuǎn)錄后過程,影響蛋白的表達,在生命的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[3,4]。肝臟組織中也發(fā)現(xiàn)了多種miRNA,但是這些miRNA有些是無功能的,有些是有功能的,需要進行相關實驗進行驗證。有研究指出Hsa-miR-660可能與CYP3A4酶活性存在相關性,但尚且沒有進行細胞水平的驗證[5]。本實驗主要研究肝細胞中Hsa-miR-660相對表達量對CYP3A4蛋白表達的影響。材料與方法 所用的細胞為人正常肝細胞chang liver,將穩(wěn)定表達的chang liver細胞培養(yǎng)于37°5%co2的培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清rpmi1640,2-3天換一次培養(yǎng)基,保證細胞可以正常生長。在細胞生長良好時可準備病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細胞鋪于6孔板上,繼續(xù)進行細胞培養(yǎng),在細胞融合度達到80%以上時可進行轉(zhuǎn)染。實驗分為四組:分別為對照組(c)、mirna過表達組(h)、mirna沉默組(l)和陰性載體組(n)。c組加入等量的完全培養(yǎng)基,l組加入包裹抑制hsa-mir-660表達質(zhì)粒的慢病毒,h組加入包裹過表達hsa-mir-660質(zhì)粒的慢病毒,n組加入包裹空載體的慢病毒進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時按moi=50加入病毒后共同培養(yǎng),24小時后將含有病毒的培養(yǎng)基吸出,加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72h后進行在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后一部分細胞提取總rna,實時熒光定量法進行測定cyp3a4mrna相對表達量和hsa-mir-660相對表達量。內(nèi)參分別為gapdh和u6。剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng),待細胞生長較為旺盛時提取總蛋白,westernblot法測定cyp3a4的相對表達量,內(nèi)參為gapdh。結果1轉(zhuǎn)染效率測定熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,h組、l組、n組三組轉(zhuǎn)染效率均為50%-70%。2hsa-mir-660相對表達量的測定實時熒光定量pcr法測定四組hsa-mir-660相對表達量,f=31.857,p〈0.05,差異有統(tǒng)計學意義.n組與c組相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(p=0.564〉0.05).h組較c組hsa-mir-660表達量顯著增加,l組較c組hsa-mir-660表達量顯著降低。h組(8.372±0.403)較n組(4.847±0.511)hsa-mir-660表達量顯著增加,l組(2.985±0.407)較n組(4.847±0.511)hsa-mir-660表達量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義。3cyp3a4mrna表達量的測定rt-pcr法測定四組cyp3a4mrna,四組mrna的表達量不存在差異,f=0.381,p=0.7680.05。4cyp3a4蛋白表達量的測定westernblot法測定四組cyp3a4蛋白相對表達量,四組之間cyp3a4蛋白的相對表達量存在統(tǒng)計學差異,f=20.225,p〈0.01。c組和n組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(p〉0.05),h組較c組cyp3a4蛋白相對表達量顯著降低,l組較c組cyp3a4蛋白相對表達量顯著升高;h組(0.00548±0.00186)較n組(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相對表達量顯著降低,l組(0.04092±0.01112)較n組(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相對表達量顯著升高,差異均存在統(tǒng)計學意義(p〈0.01)。結論 1、Hsa-miR-660并不影響CYP3A4 m RNA的穩(wěn)定性。2、細胞水平上Hsa-miR-660抑制了CYP3A4蛋白的表達。
【關鍵詞】：Hsa-miR-660 CYP3A4 chang liver細胞系
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 英文縮寫索引12-13
• 前言13-16
• 材料和方法16-27
• 實驗結果27-30
• 討論30-33
• 結論33-34
• 參考文獻34-36
• 綜述 microRNA與阿片類藥物的相關性研究36-54
• 參考文獻50-54
• 個人簡歷及碩士期間論文發(fā)表情況54-55
• 致謝55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 歐陽松應,楊冬,歐陽紅生,馬鶴雯;實時熒光定量PCR技術及其應用[J];生命的化學;2004年01期

2 ;MicroRNA signatures in liver diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2009年14期

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本文編號：777412