本文關(guān)鍵詞：胰高血糖素樣肽-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸黏膜屏障損傷的保護(hù)作用研究

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【摘要】：全腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition, TPN)應(yīng)用于臨床治療已有近半個世紀(jì),它不但可以維護(hù)機(jī)體正常生理活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)與能量,而且還可改善營養(yǎng)狀況和促進(jìn)康復(fù)。目前,TPN己在臨床廣乏應(yīng)用于腸衰竭病人的救治,特別是短腸綜合征的營養(yǎng)支持。然而,長期的TPN支持會導(dǎo)致腸道黏膜萎縮、破壞,免疫功能障礙,從而增加腸道細(xì)菌易位和感染并發(fā)癥等風(fēng)險的發(fā)生,嚴(yán)重的甚至可導(dǎo)致腸源性敗血癥,但其機(jī)制仍未完全明確。如何有效地避免或減少TPN治療所導(dǎo)致的這些并發(fā)癥發(fā)生是當(dāng)前外科營養(yǎng)治療領(lǐng)域的重要問題。胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)是一種腸道特異性的生長因子,它具有增加腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,改善腸道血流的供應(yīng),促進(jìn)腸黏膜損傷的修復(fù)與維持腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性等作用,近年來越來越受到學(xué)者的關(guān)注。GLP-2與其他多肽類生長因子不同的是其發(fā)揮生理功能或藥理作用強(qiáng),且具有特異性(僅局限于胃腸道),在應(yīng)用于治療腸道屏障功能障礙的疾病中前景廣闊。替度魯肽(Teduglutide)是一種人GLP-2的類似物,目前用在治療短腸綜合征和炎癥性腸病進(jìn)行了III期臨床試驗(yàn),并已取得了良好的療效。研究表明,外源性補(bǔ)充GLP-2類似物可以使短腸綜合征病人減少對腸外營養(yǎng)的依賴和改善其生活質(zhì)量。短腸綜合征病人的腸內(nèi)外營養(yǎng)支持治療的最終目的之一是希望能夠擺脫腸外營養(yǎng),依靠腸內(nèi)營養(yǎng)甚至口服進(jìn)食來維持生存。但長期的TPN治療可導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損,甚至發(fā)生細(xì)菌易位和感染并發(fā)生癥等風(fēng)險,而治療短腸綜合征的新藥—GLP-2類似物具有特異性地修復(fù)腸上皮細(xì)胞以及維持腸黏膜屏障的完整性等作用,因此,探討GLP-2對TPN導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷具有十分重要的臨床意義。長期的TPN支持不僅可以導(dǎo)致腸黏膜機(jī)械屏障的損傷,而且還會引起腸黏膜免疫屏障的破壞。最近研究表明,GLP-2不但可保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障,而還可能在腸道黏膜免疫反應(yīng)中起著重要的作用。在休克復(fù)蘇大鼠模型中,GLP-2可以增加大鼠膽汁中的sIgA分泌水平；在給予GLP-2治療重癥急性胰腺炎的小鼠中發(fā)現(xiàn),該組小鼠腸黏膜的CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞和IgAλ表達(dá)水平增加,這進(jìn)一步說明了GLP-2對腸道黏膜免疫屏障有一定的保護(hù)作用。但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)GLP-2對TPN動物模型的腸黏膜免疫屏障影響的相關(guān)研究。針對TPN導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷所帶來一系列并發(fā)癥這一常見的臨床問題,并鑒于GLP-2對腸道黏膜上皮細(xì)胞有較確切的保護(hù)作用,我們設(shè)計(jì)動物實(shí)驗(yàn)來探討GLP-2對TPN動物模型腸黏膜屏障的影響。我們首先通過頸外靜脈置管建立TPN小鼠模型,觀察GLP-2是否可以預(yù)防TPN導(dǎo)致的腸黏膜萎縮。更進(jìn)一步的研究是,觀察GLP-2是否可以保護(hù)TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷以及其相關(guān)的保護(hù)機(jī)制。另一方面,我們也初步探討GLP-2是否可改善TPN所致的腸粘膜免疫損傷。第一章：GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道萎縮的預(yù)防作用目的探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)(TPN)導(dǎo)致的腸道萎縮的影響。方法選取6-8周健康ICR小鼠(n=24,33.6±1.1),隨機(jī)平均分為3組：自由進(jìn)食組(Chow組)、全腸外營養(yǎng)組(TPN組)和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組(TPN+GLP-2組)。氯胺酮腹腔注射進(jìn)行麻醉,頸外靜脈置管2d后,TPN組給予全腸外營養(yǎng)液,TPN+GLP-2組除給予等量上述營養(yǎng)液外還經(jīng)頸外靜脈注射30ug/次GLP-2,一天2次(共60ug/d)。每天定時稱量小鼠體重,于第7d處死小鼠,取出小腸并測量,留取回腸末端組織檢測相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)量,并觀察腸黏膜的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果與chow組比較,TPN組小鼠的體重下降明顯,小腸長度明顯縮短,小腸絨毛高度和微絨毛變矮以及隱窩深度變淺(均P0.05)。而GLP-2組小鼠的上述指標(biāo)均有所改善(均P0.05)。GLP-2可增加TPN小鼠腸組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白與mRNA的表達(dá),減少腸組織cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)論GLP-2可以預(yù)防TPN小鼠腸黏膜萎縮,其機(jī)制可能是通過刺激腸上皮組織PCNA蛋白與mRNA的表達(dá)以及減少cleaved caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。第二章：GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道機(jī)械屏障的影響目的探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)(TPN)小鼠腸道機(jī)械屏障的影響及相關(guān)機(jī)制。方法將36只正常健康ICR小鼠隨機(jī)平均分為3組：自由進(jìn)食組(Chow組)、全腸外營養(yǎng)組(TPN組)和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組(TPN+GLP-2組)。經(jīng)頸外靜脈置管2d后,TPN組給予全腸外營養(yǎng)液,TPN+GLP-2組除給予等量上述營養(yǎng)液外還注射30ug/次GLP-2,一天2次(共60ug/d)。在第7d處死小鼠,留取眼球靜脈血,留取回腸末端組織檢測相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá),使用透射電子顯微鏡觀察腸黏膜組織的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果與Chow組比較,TPN組小鼠血清IL-6和TNF-α水平顯著升高,而IL-10下降(均P0.05),與TPN組比較,TPN+GLP-2組血清的IL-6和TNF-α水平降低,IL-10水平升高(均P0.05)。TPN、TPN+GLP-2組的IL-6、TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)也與其血清水平變化相一致(均P0.05)。與Chow比較,TPN組小鼠的血漿內(nèi)毒素和D-乳酸水平升高(均P0.05),而TPN+GLP-2組的變化不明顯(均P0.05)。與Chow組比較,TPN組小鼠的MPO含量與Caspase-3活性增加(P0.05),而TPN+GLP-2組的變化不顯著(均P0.05)。電鏡觀察結(jié)果顯示,與Chow組比較,TPN組小鼠微絨毛稀少,排列不齊,出現(xiàn)倒伏、脫落,緊密連接蛋白遭到破壞,而TPN+GLP-2組的微絨毛稍整齊,緊密連接蛋白破壞不明顯；免疫熒光結(jié)果表明,與Chow組比較,TPN組腸組織的緊密連接Occludin、Caudin-1和ZO-1蛋白熒光較少,不連續(xù),而TPN+GLP-2組的變化不明顯。Western blot結(jié)果顯示,與Chow組比較,TPN組小鼠腸組織的緊密連接蛋白Occludin、Caudin-1表達(dá)減少(均P0.05),而TPN+GLP-2組的與Chow組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。TPN組小鼠腸組織PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)減少(均P0.05),而Bax蛋白表達(dá)增加(均P0.05)；相反,TPN+GLP-2組的變化與Chow組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。結(jié)論1.TPN支持5天后可導(dǎo)致小鼠腸黏膜機(jī)械屏障受損,表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng)增強(qiáng),血漿內(nèi)毒素增加,緊密連接蛋白遭到破壞等。2.GLP-2可改善TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷,其體現(xiàn)在GLP-2可減輕腸組織的病理損傷及緊密連接蛋白損傷,降低腸黏膜通透性,降低炎癥因子的表達(dá)等。3.GLP-2保護(hù)TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷機(jī)制可能是促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖、抑制其細(xì)胞凋亡以及減輕腸組織炎癥反應(yīng),從而對腸黏膜機(jī)械屏障起保護(hù)作用。第三章：GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道免疫屏障的影響目的探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)(TPN)小鼠腸道黏膜免疫屏障的影響。方法將30只6-8周的健康ICR小鼠隨機(jī)平均分為3組：自由進(jìn)食組(Chow組)、全腸外營養(yǎng)組(TPN組)和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組(TPN+GLP-2組)。在頸外靜脈置管2d后,TPN組給予全腸外營養(yǎng)液,TPN+GLP-2組除給予等量上述營養(yǎng)液外還注射30ug/次GLP-2,一天2次(共60ug/d)。第7d后處死小鼠,留取門靜脈血檢測細(xì)菌易位率,留取小腸腸腔沖洗液檢測sIgA含量,取回腸末端組織檢測IL-4、IL-13等相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá),檢測回腸末端組織sIgA水平,并做相關(guān)蛋白的免疫熒光染色檢測,留取回腸末端組織作PAS染色觀察小腸杯狀細(xì)胞數(shù)目的變化。結(jié)果與TPN組比較,TPN+GLP-2組小鼠的回腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)目明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,與Chow組比較,TPN組小鼠的腸組織和沖洗液中的sIgA含量、腸組織IL-4和IL-13水平均減少(均P0.05)。而與TPN組比較,TPN+GLP-2組的腸組織和沖洗液中sIgA含量、腸組織IL-4和IL-13水平均有所增加(均P0.05)。與Chow組比較,TPN顯著減少腸組織的sPLA2和cryptdin-4的水平(均P0.05),而與TPN組比較,注射GLP-2后可改善腸組織的sPLA2和cryptdin-4水平(均P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,與TPN組比較,TPN+GLP-2組的lysozyme與PIgR蛋白表達(dá)均增加(均P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,與TPN組比較,TPN+GLP-2組小鼠的IL-4 mRNA、IL-13 mRNA、Lysozyme mRNA、pIgR mRNA、SPLA2 mRNA、Mucin2 mRNA和Cryptdin 4 mRNA表達(dá)均增加(均P0.05),但Tff3 mRNA與RegⅢ-γ mRNA的表達(dá)均無明顯差異。另外,與TPN組比較,TPN+GLP-2組小鼠血清中精氨酸和瓜氨酸水平顯著升高(均P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示,與TPN組比較,TPN+GLP-2組的Lysozyme和PIgR蛋白熒光較多,且較連續(xù)。另外與TPN組比較,TPN+GLP-2組的門靜脈血、肝與脾的總的細(xì)菌易位率明顯降低(均P0.05)。結(jié)論1.TPN可導(dǎo)致腸黏膜免疫屏障損傷,包括固有免疫與獲得性免疫的損傷。2.GLP-2可減少TPN導(dǎo)致的細(xì)菌易位率,可能與提高腸道黏膜免疫相關(guān)。3.GLP-2可改善TPN導(dǎo)致的腸黏膜免疫損傷,主要體現(xiàn)在增加腸組織sIgA、lysozyme、sPLA2和cryptdin 4的分泌,其相關(guān)機(jī)制可能與增加血中精氨酸、瓜氨酸及改善腸道組織中IL-4和IL-13有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：胰高血糖素樣肽-2 全腸外營養(yǎng) 腸萎縮 腸黏膜機(jī)械屏障 腸黏膜免疫屏障
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-23
• 第一章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道萎縮的預(yù)防作用23-42
• 1. 材料和方法23-34
• 2. 結(jié)果34-40
• 3. 討論40-41
• 4. 小結(jié)41-42
• 第二章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道機(jī)械屏障的影響42-64
• 1. 材料與方法43-50
• 2. 結(jié)果50-60
• 3. 討論60-63
• 4. 小結(jié)63-64
• 第三章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道免疫屏障的影響64-91
• 1. 材料與方法65-74
• 2. 結(jié)果74-88
• 3. 討論88-90
• 4. 小結(jié)90-91
• 全文總結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-106
• 附錄 (中英文縮略詞表)106-107
• 綜述107-119
• 參考文獻(xiàn)112-119
• 攻讀學(xué)位期間的成果(發(fā)表文章)119-120
• 致謝120-122

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本文編號：775155