發(fā)布時間：2017-09-01 08:04

  本文關(guān)鍵詞：預(yù)防性應(yīng)用重組日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑減輕小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎

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【摘要】：背景類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、嚴重危害健康的自身免疫性疾病,該疾病的發(fā)病率高愈后差,目前仍然沒有徹底有效的治療方法。研究發(fā)現(xiàn),RA的發(fā)病機制與病理發(fā)展過程與激活的效應(yīng)T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞密切相關(guān)。根據(jù)實驗室前期利用CIA模型感染日本血吸蟲的實驗研究發(fā)現(xiàn),Thl和Thl7細胞刺激并維持了關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng),而由血吸蟲誘導(dǎo)的Th2和Tregs免疫偏移可恢復(fù)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎中產(chǎn)生的Th免疫應(yīng)答的失衡,從而探討了蠕蟲在RA治療中的潛在應(yīng)用價值。然而利用蠕蟲直接感染治療相關(guān)自身免疫性疾病,存在過度感染的風險,難以控制感染程度和效果。SjCy statin是日本血吸蟲蟲源性分子,已經(jīng)有體外實驗研究證明其具有酶活性和負向免疫調(diào)節(jié)的作用,主要是抑制木瓜蛋白酶的水解活性和MHC-Ⅱ類抗原遞呈的作用,并可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M2方向極化。已有研究表明,絲蟲的Cystatin同樣具有抑制MHC-Ⅱ類抗原遞呈的作用和免疫抑制的作用,其可以下調(diào)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng),并且在對炎癥性腸病(IBD)動物模型的治療中取得了良好的效果。目的本研究主要利用日本血吸蟲蟲源性蛋白rSjCytatin在不同時間點應(yīng)用于膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型,觀察其對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用或治療效果。通過評價小鼠的發(fā)病率、疾病的嚴重程度,結(jié)合CD4+T細胞亞群的變化,研究并發(fā)現(xiàn)新型蠕蟲源性免疫調(diào)節(jié)生物制劑對RA的潛在應(yīng)用價值。方法構(gòu)建、表達并純化出重組的蛋白rSjCytatin,去除咪唑,測定蛋白濃度。構(gòu)建DBA/1小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型(CIA),分別用100μg/次rSjCytatin于造模前4周、造模后4周經(jīng)腹腔注射小鼠,SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。所有小鼠從造模后第21天開始記錄發(fā)病率、臨床關(guān)節(jié)炎評分以評估小鼠關(guān)節(jié)炎的的病變發(fā)生時間和發(fā)病的嚴重程度。造模后第42天在麻醉的情況下無痛處死小鼠,收集標本：血清、足爪組織、膝關(guān)節(jié)、脾臟等。標本經(jīng)處理后,H-E染色小鼠膝關(guān)節(jié)腔切片,微觀評分小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化；ELISA檢測小鼠血清內(nèi)抗CⅡ特異性總IgG及其亞型IgGl、IgG2a,比較預(yù)防性應(yīng)用與延遲性注射rSjCytatin對小鼠自身體液免疫抗體形成的影響；ELISA檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清內(nèi)細胞因子表達量；流式細胞術(shù)檢測脾臟淋巴細胞中CD4+T細胞中個亞群比例：Th1、Th2、Th17和Treg細胞,判斷rSjCytatin應(yīng)用于CIA小鼠對其外周效應(yīng)T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞比例的影響；qPCR檢測CIA小鼠足爪炎癥組織內(nèi)各細胞因子的,mRNA表達水平。結(jié)果與CIA陽性對照組小鼠相比,rSjCytatin的預(yù)防性應(yīng)用顯著減輕了誘導(dǎo)的小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率與疾病臨床大體評分(AI),改善了病理微觀評分,降低了炎癥嚴重程度；血清中的抗CⅡ特異性IgG2a顯著下降,而抗CⅡ特異性IgG1水平明顯升高；脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-6.表達水平降低,同時伴隨著IL-4和IL-10的表達升高；脾淋巴細胞中IFN-γ+CD4+T細胞(Thl)比例顯著下降同時IL-4+CD4+T細胞(Th2)比例明顯上升；Foxp3+CD25+CD4+T細胞(Treg)上升同時IL-17+CD4+T細胞(Th17)比例明顯下降；CIA小鼠足爪組織的RANKL和炎癥因子的mRNA的表達水平下降。而對于已經(jīng)建立關(guān)節(jié)炎的小鼠,rSjCytatin的延遲治療并不能改變其關(guān)節(jié)炎的嚴重程度與病情,在各項指標檢測中,只有Tregs和IL-10的輕微升高。結(jié)論重組日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑(rSjcystatin),能夠通過預(yù)防性干預(yù)能有效地降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的發(fā)病率、改善CIA小鼠的臨床參數(shù)、緩解關(guān)節(jié)炎的病理嚴重程度；通過檢測檢測各項指標可知,預(yù)防性應(yīng)用rSjcystatin在CIA小鼠中起到的的良好效果歸于其產(chǎn)生的負向免疫調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎 日本血吸蟲 半胱氨酸蛋白酶抑制劑 免疫調(diào)節(jié)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 英文縮略詞對照表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 1. 前言11-13
• 2. 材料與方法13-24
• 3. 結(jié)果24-34
• 4. 討論34-37
• 5. 結(jié)論37-38
• 6. 參考文獻38-44
• 附錄44-57
• 附錄一 個人簡歷44-45
• 附錄二 致謝45-46
• 附錄三 綜述46-57
• 參考文獻51-57

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