本文關(guān)鍵詞：塑化劑DEHP對雄性動物的生殖毒性研究

  更多相關(guān)文章： DEHP 雄性生殖毒性 類固醇激素快速調(diào)節(jié)蛋白 精子 超微結(jié)構(gòu)

【摘要】：在2011年4月,臺灣發(fā)生了震驚海內(nèi)外的起云劑事件:衛(wèi)生部門在對食品進行抽樣檢查時,發(fā)現(xiàn)“凈元益生菌”粉末的檢測結(jié)果出現(xiàn)異樣,經(jīng)過調(diào)查確認,此異樣為塑化劑DEHP,其濃度高達600ppm(百萬分之一),是來自臺灣最大的起云劑供應商-昱伸香料公司所供應的起云劑內(nèi)。到6月13日,受塑化劑污染的問題企業(yè)增加到294家,相關(guān)受到影響的產(chǎn)品增加到973種。這起事件在臺灣島內(nèi)食品界、中國大陸食品界,甚至整個亞洲食品界引起巨大轟動的同時,也將塑化劑這一物質(zhì)全面地帶入人們的視線。塑化劑在工業(yè)生產(chǎn)上使用范圍較廣,其中使用最多應用最廣泛的是鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP),到2012年,DEHP在我國的生產(chǎn)量約為400萬噸,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),我國每升地下水中DEHP含量約為100μg,而每千克的沉積物中DEHP含量約為200mg。近年來的文獻報道,DEHP有多種毒性作用,其中最主要的就是其生殖毒性。為了探討DEHP的雄性生殖毒性及其作用機制,我們針對DEHP進行了動物實驗,我們設(shè)置了對照組(玉米油組)、100mg/kg DEHP低劑量組、500mg/kg DEHP中劑量組和1500mg/kg DEHP高劑量組,采用這4個含不同濃度DEHP的劑量組對40只青春期SD雄性大鼠進行灌胃染毒,根據(jù)其體重調(diào)節(jié)給藥量,每天染毒1次,每周5天,共染毒6周。染毒期間觀察大鼠的生命活動是否正常,待染毒結(jié)束后,用乙醚將大鼠麻醉,稱量其體質(zhì)量,然后迅速摘取其雙側(cè)睪丸并記錄睪丸濕重,之后取一部分睪丸進行病理與電鏡檢查,以觀察DEHP對大鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的影響。另外提取睪丸組織RNA,通過進行實時熒光定量PCR實驗,測定2個凋亡基因“Caspase-3、Caspase-8”,6個與激素合成有關(guān)的基因“類固醇激素快速調(diào)節(jié)蛋白(St AR)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)、17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)、促性腺激素釋放激素(Gn RH)及雌激素受體(ERα、ERβ)”共8個基因表達水平的變化,同時提取睪丸組織總蛋白,采用Western Blot法測定3個相關(guān)蛋白“促性腺激素釋放激素受體(Gn RHR)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)及卵泡刺激素受體(FSHR)”的蛋白表達水平變化。動物實驗研究發(fā)現(xiàn):DEHP染毒期間,各組大鼠飲食及生命體征均正常。染毒結(jié)束后,各組大鼠間體重及體重增長量均無統(tǒng)計學差異(p0.05),但是在DEHP高劑量組內(nèi),大鼠睪丸濕重及睪丸臟器系數(shù)比較對照組均顯著降低(p0.01),說明DEHP可以通過影響睪丸正常的生長來影響雄性大鼠的生殖功能。睪丸經(jīng)HE染色后,普通光學顯微鏡下觀察睪丸病理學的變化,結(jié)果顯示,DEHP低劑量組支持細胞有輕微程度的脫落。DEHP中劑量組內(nèi)各級生精細胞減少且排列異常,支持細胞有輕微脫落。DEHP高劑量組可見睪丸生精小管嚴重萎縮,各級生精細胞大量喪失,支持細胞成空泡狀,間質(zhì)細胞發(fā)生異常增生現(xiàn)象,這些說明DEHP可以通過影響睪丸內(nèi)支持細胞、間質(zhì)細胞與各級生精細胞而產(chǎn)生雄性生殖毒性功能。電鏡檢查發(fā)現(xiàn),DEHP低劑量組顯示生精細胞的細胞核出現(xiàn)核內(nèi)包含物,胞質(zhì)內(nèi)空泡增多,線粒體輕度腫脹,可見線粒體內(nèi)出現(xiàn)斷嵴、脫顆�，F(xiàn)象,精子細胞頭部有內(nèi)含物,精子細胞的線粒體鞘異常。DEHP中劑量組顯示精原細胞核內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細胞膜不完整,胞質(zhì)內(nèi)的線粒體數(shù)量少,胞質(zhì)內(nèi)有大量的空化現(xiàn)象;次級精母細胞及精子細胞的發(fā)育異常,精子頭部的電子密度降低,精子尾部頸段及中段(線粒體鞘)超微結(jié)構(gòu)異常,線粒體數(shù)量減少,出現(xiàn)空化及髓樣變化,精子尾部未見微管結(jié)構(gòu)。DEHP高劑量組顯示細胞結(jié)構(gòu)紊亂,未見精細胞,可見細胞核體積較大,核凹陷嚴重且成畸形,核漿比值增大,核膜不光滑且有切跡,核異染色質(zhì)附著在核膜下,線粒體數(shù)量增多且形態(tài)多樣,線粒體嵴減少,細胞器少,細胞有變性壞死的病理改變,睪丸間質(zhì)細胞的細胞核嚴重變形,核仁固縮,細胞內(nèi)出現(xiàn)包含物,細胞核內(nèi)的異染色質(zhì)增多。這部分結(jié)果表明DEHP可以影響睪丸內(nèi)支持細胞、間質(zhì)細胞與各級生精細胞的超微結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生雄性生殖毒性。通過對基因表達水平的檢測分析發(fā)現(xiàn),癌基因Caspase-3與Caspase-8基因的表達水平在DEHP高劑量組升高(p0.01),在與激素合成有關(guān)的基因中,St AR、3β-HSD基因表達水平在DEHP各劑量組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.01或p0.05);17β-HSD基因表達水平只在DEHP高劑量組升高(p0.01),而低劑量組和中劑量組無明顯改變(p0.05);ERα基因表達水平在DEHP高劑量組升高(p0.01);ERβ基因表達水平在DEHP低劑量組和中劑量組下降(p0.01),但在DEHP高劑量組升高(p0.01);Gn RH基因表達水平在DEHP中劑量組和高劑量組均顯著下降(p0.01或p0.05)。這些從分子水平說明,DEHP產(chǎn)生雄性生殖毒性作用與影響睪丸相關(guān)激素基因表達水平改變存在密切關(guān)系。在Western Blot實驗中發(fā)現(xiàn),與對照組相比,在DEHP高劑量組內(nèi),Gn RHR與FSHR蛋白表達水平均顯著下降(p0.01或p0.05),3β-HSD蛋白表達水平顯著升高(p0.05)。這部分結(jié)果與基因表達結(jié)果一致,同樣從分子水平上說明DEHP可以影響睪丸內(nèi)激素正常的合成并產(chǎn)生雄性生殖毒性。因此,本文通過動物實驗,重點研究DEHP的雄性生殖毒性,發(fā)現(xiàn)DEHP可以通過影響睪丸支持細胞與睪丸間質(zhì)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能來影響精子的發(fā)生與成熟,進而引起雄性生殖毒性,對于揭示DEHP的雄性生殖毒性作用機制提供了科學依據(jù),對今后深入研究塑化劑對人群的健康危害具有重要的理論意義和實際應用價值。
【關(guān)鍵詞】：DEHP 雄性生殖毒性 類固醇激素快速調(diào)節(jié)蛋白 精子 超微結(jié)構(gòu)
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一章 前言12-24
• 1.1 塑化劑的研究進展12-18
• 1.1.1 DEHP的理化性質(zhì)12-13
• 1.1.2 DEHP的吸收與代謝13-14
• 1.1.3 DEHP在人群中的污染情況14-15
• 1.1.4 DEHP的毒性15-18
• 1.2 雄性動物的睪丸組織18-21
• 1.2.1 睪丸的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.2 睪丸正常功能的發(fā)揮19-21
• 1.3 雌激素受體ERα 與ERβ21-22
• 1.4 凋亡基因Caspase-3 和Caspase-822-24
• 第二章 材料與方法24-44
• 2.1 實驗樣本的獲得24-25
• 2.1.1 實驗試劑與材料24
• 2.1.2 動物模型的建立24-25
• 2.2 光鏡觀察睪丸病理結(jié)構(gòu)改變25-29
• 2.2.1 實驗材料25-26
• 2.2.2 主要試劑的配制26
• 2.2.3 技術(shù)路線26-29
• 2.3 電鏡下睪丸超微結(jié)構(gòu)的檢測29-33
• 2.3.1 材料與方法29-30
• 2.3.2 主要試劑的配置30-31
• 2.3.3 透射電鏡觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)的技術(shù)路線31-33
• 2.4 實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達水平的改變33-38
• 2.4.1 材料與方法33-34
• 2.4.2 實時熒光定量PCR（Real- Time PCR）檢測相關(guān)基因改變的技術(shù)路線34-38
• 2.5 Western Blot檢測激素相關(guān)蛋白表達水平的改變38-44
• 2.5.1 材料與方法38-39
• 2.5.2 主要試劑的配制39-40
• 2.5.3 Western Blot檢測激素相關(guān)蛋白表達水平改變的技術(shù)路線40-44
• 第三章 結(jié)果44-56
• 3.1 動物的一般體征44
• 3.2 睪丸的摘取及臟器系數(shù)44-45
• 3.3 睪丸病理結(jié)構(gòu)的改變45
• 3.4 睪丸超微結(jié)構(gòu)的改變45-47
• 3.5 實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達水平的改變47-53
• 3.5.1 Real-Time PCR條件探索及引物標準曲線和溶解曲線 3647-51
• 3.5.2 目的基因表達水平的變化51-53
• 3.6 Western Blot檢測目的蛋白表達水平的變化53-56
• 第四章 討論56-60
• 第五章 結(jié)論60-62
• 參考文獻62-68
• 附錄68-70
• 致謝70-72
• 攻讀碩士學位期間的研究成果72-73

【參考文獻】

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本文編號：763897