本文關(guān)鍵詞：塑化劑DEHP對(duì)雄性動(dòng)物的生殖毒性研究

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【摘要】：在2011年4月,臺(tái)灣發(fā)生了震驚海內(nèi)外的起云劑事件:衛(wèi)生部門在對(duì)食品進(jìn)行抽樣檢查時(shí),發(fā)現(xiàn)“凈元益生菌”粉末的檢測結(jié)果出現(xiàn)異樣,經(jīng)過調(diào)查確認(rèn),此異樣為塑化劑DEHP,其濃度高達(dá)600ppm(百萬分之一),是來自臺(tái)灣最大的起云劑供應(yīng)商-昱伸香料公司所供應(yīng)的起云劑內(nèi)。到6月13日,受塑化劑污染的問題企業(yè)增加到294家,相關(guān)受到影響的產(chǎn)品增加到973種。這起事件在臺(tái)灣島內(nèi)食品界、中國大陸食品界,甚至整個(gè)亞洲食品界引起巨大轟動(dòng)的同時(shí),也將塑化劑這一物質(zhì)全面地帶入人們的視線。塑化劑在工業(yè)生產(chǎn)上使用范圍較廣,其中使用最多應(yīng)用最廣泛的是鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP),到2012年,DEHP在我國的生產(chǎn)量約為400萬噸,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),我國每升地下水中DEHP含量約為100μg,而每千克的沉積物中DEHP含量約為200mg。近年來的文獻(xiàn)報(bào)道,DEHP有多種毒性作用,其中最主要的就是其生殖毒性。為了探討DEHP的雄性生殖毒性及其作用機(jī)制,我們針對(duì)DEHP進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn),我們?cè)O(shè)置了對(duì)照組(玉米油組)、100mg/kg DEHP低劑量組、500mg/kg DEHP中劑量組和1500mg/kg DEHP高劑量組,采用這4個(gè)含不同濃度DEHP的劑量組對(duì)40只青春期SD雄性大鼠進(jìn)行灌胃染毒,根據(jù)其體重調(diào)節(jié)給藥量,每天染毒1次,每周5天,共染毒6周。染毒期間觀察大鼠的生命活動(dòng)是否正常,待染毒結(jié)束后,用乙醚將大鼠麻醉,稱量其體質(zhì)量,然后迅速摘取其雙側(cè)睪丸并記錄睪丸濕重,之后取一部分睪丸進(jìn)行病理與電鏡檢查,以觀察DEHP對(duì)大鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的影響。另外提取睪丸組織RNA,通過進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),測定2個(gè)凋亡基因“Caspase-3、Caspase-8”,6個(gè)與激素合成有關(guān)的基因“類固醇激素快速調(diào)節(jié)蛋白(St AR)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)、17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)、促性腺激素釋放激素(Gn RH)及雌激素受體(ERα、ERβ)”共8個(gè)基因表達(dá)水平的變化,同時(shí)提取睪丸組織總蛋白,采用Western Blot法測定3個(gè)相關(guān)蛋白“促性腺激素釋放激素受體(Gn RHR)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)及卵泡刺激素受體(FSHR)”的蛋白表達(dá)水平變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):DEHP染毒期間,各組大鼠飲食及生命體征均正常。染毒結(jié)束后,各組大鼠間體重及體重增長量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但是在DEHP高劑量組內(nèi),大鼠睪丸濕重及睪丸臟器系數(shù)比較對(duì)照組均顯著降低(p0.01),說明DEHP可以通過影響睪丸正常的生長來影響雄性大鼠的生殖功能。睪丸經(jīng)HE染色后,普通光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸病理學(xué)的變化,結(jié)果顯示,DEHP低劑量組支持細(xì)胞有輕微程度的脫落。DEHP中劑量組內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞減少且排列異常,支持細(xì)胞有輕微脫落。DEHP高劑量組可見睪丸生精小管嚴(yán)重萎縮,各級(jí)生精細(xì)胞大量喪失,支持細(xì)胞成空泡狀,間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常增生現(xiàn)象,這些說明DEHP可以通過影響睪丸內(nèi)支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞而產(chǎn)生雄性生殖毒性功能。電鏡檢查發(fā)現(xiàn),DEHP低劑量組顯示生精細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)核內(nèi)包含物,胞質(zhì)內(nèi)空泡增多,線粒體輕度腫脹,可見線粒體內(nèi)出現(xiàn)斷嵴、脫顆粒現(xiàn)象,精子細(xì)胞頭部有內(nèi)含物,精子細(xì)胞的線粒體鞘異常。DEHP中劑量組顯示精原細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細(xì)胞膜不完整,胞質(zhì)內(nèi)的線粒體數(shù)量少,胞質(zhì)內(nèi)有大量的空化現(xiàn)象;次級(jí)精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的發(fā)育異常,精子頭部的電子密度降低,精子尾部頸段及中段(線粒體鞘)超微結(jié)構(gòu)異常,線粒體數(shù)量減少,出現(xiàn)空化及髓樣變化,精子尾部未見微管結(jié)構(gòu)。DEHP高劑量組顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,未見精細(xì)胞,可見細(xì)胞核體積較大,核凹陷嚴(yán)重且成畸形,核漿比值增大,核膜不光滑且有切跡,核異染色質(zhì)附著在核膜下,線粒體數(shù)量增多且形態(tài)多樣,線粒體嵴減少,細(xì)胞器少,細(xì)胞有變性壞死的病理改變,睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核嚴(yán)重變形,核仁固縮,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包含物,細(xì)胞核內(nèi)的異染色質(zhì)增多。這部分結(jié)果表明DEHP可以影響睪丸內(nèi)支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生雄性生殖毒性。通過對(duì)基因表達(dá)水平的檢測分析發(fā)現(xiàn),癌基因Caspase-3與Caspase-8基因的表達(dá)水平在DEHP高劑量組升高(p0.01),在與激素合成有關(guān)的基因中,St AR、3β-HSD基因表達(dá)水平在DEHP各劑量組均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01或p0.05);17β-HSD基因表達(dá)水平只在DEHP高劑量組升高(p0.01),而低劑量組和中劑量組無明顯改變(p0.05);ERα基因表達(dá)水平在DEHP高劑量組升高(p0.01);ERβ基因表達(dá)水平在DEHP低劑量組和中劑量組下降(p0.01),但在DEHP高劑量組升高(p0.01);Gn RH基因表達(dá)水平在DEHP中劑量組和高劑量組均顯著下降(p0.01或p0.05)。這些從分子水平說明,DEHP產(chǎn)生雄性生殖毒性作用與影響睪丸相關(guān)激素基因表達(dá)水平改變存在密切關(guān)系。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,在DEHP高劑量組內(nèi),Gn RHR與FSHR蛋白表達(dá)水平均顯著下降(p0.01或p0.05),3β-HSD蛋白表達(dá)水平顯著升高(p0.05)。這部分結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致,同樣從分子水平上說明DEHP可以影響睪丸內(nèi)激素正常的合成并產(chǎn)生雄性生殖毒性。因此,本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),重點(diǎn)研究DEHP的雄性生殖毒性,發(fā)現(xiàn)DEHP可以通過影響睪丸支持細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能來影響精子的發(fā)生與成熟,進(jìn)而引起雄性生殖毒性,對(duì)于揭示DEHP的雄性生殖毒性作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù),對(duì)今后深入研究塑化劑對(duì)人群的健康危害具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：DEHP 雄性生殖毒性 類固醇激素快速調(diào)節(jié)蛋白 精子 超微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一章 前言12-24
• 1.1 塑化劑的研究進(jìn)展12-18
• 1.1.1 DEHP的理化性質(zhì)12-13
• 1.1.2 DEHP的吸收與代謝13-14
• 1.1.3 DEHP在人群中的污染情況14-15
• 1.1.4 DEHP的毒性15-18
• 1.2 雄性動(dòng)物的睪丸組織18-21
• 1.2.1 睪丸的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.2 睪丸正常功能的發(fā)揮19-21
• 1.3 雌激素受體ERα 與ERβ21-22
• 1.4 凋亡基因Caspase-3 和Caspase-822-24
• 第二章 材料與方法24-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)樣本的獲得24-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料24
• 2.1.2 動(dòng)物模型的建立24-25
• 2.2 光鏡觀察睪丸病理結(jié)構(gòu)改變25-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.2.2 主要試劑的配制26
• 2.2.3 技術(shù)路線26-29
• 2.3 電鏡下睪丸超微結(jié)構(gòu)的檢測29-33
• 2.3.1 材料與方法29-30
• 2.3.2 主要試劑的配置30-31
• 2.3.3 透射電鏡觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)的技術(shù)路線31-33
• 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平的改變33-38
• 2.4.1 材料與方法33-34
• 2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real- Time PCR）檢測相關(guān)基因改變的技術(shù)路線34-38
• 2.5 Western Blot檢測激素相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變38-44
• 2.5.1 材料與方法38-39
• 2.5.2 主要試劑的配制39-40
• 2.5.3 Western Blot檢測激素相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變的技術(shù)路線40-44
• 第三章 結(jié)果44-56
• 3.1 動(dòng)物的一般體征44
• 3.2 睪丸的摘取及臟器系數(shù)44-45
• 3.3 睪丸病理結(jié)構(gòu)的改變45
• 3.4 睪丸超微結(jié)構(gòu)的改變45-47
• 3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平的改變47-53
• 3.5.1 Real-Time PCR條件探索及引物標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線 3647-51
• 3.5.2 目的基因表達(dá)水平的變化51-53
• 3.6 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)水平的變化53-56
• 第四章 討論56-60
• 第五章 結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 附錄68-70
• 致謝70-72
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果72-73

【參考文獻(xiàn)】

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