本文關鍵詞：負載吲哚菁綠的介孔硅納米探針在肝癌術中精準導航方法的研究

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【摘要】：研究背景：世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表的《全球癌癥報告201.4》),肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為6%和9%。同時,在全球范圍內來看,肝癌在腫瘤相關性死亡病因里排名第二。2012年全球新發(fā)肝癌病例大約為782500。中國的人口只占世界總人口的1/4,但肝癌患者數大約占了全球肝癌患者的1/2,是實實在在的肝癌大國。在過去的50年里,雖然全球在不斷的增加腫瘤治療方面的研究資金,比如美國,在2009年的美國國家癌癥研究所科研預算就達到了60億美金,然而,縱觀50年來癌癥的治療效果,并沒有顯著的改善,肝癌也是如此。目前的肝臟腫瘤治療方法主要有(1)手術治療；(2)肝臟移植；(3)化學藥物治療；(4)消融療法；(5)中醫(yī)中藥治療以及以上方法的聯合治療。其中,手術切除和肝臟移植是最有可能治愈肝癌的方法；但是肝臟移植由于受到供肝來源少,受體匹配條件高,費用高昂等原因,肝臟移植并不能廣泛的應用于臨床。因此,目前手術治療被認為是首選的最有可能治愈肝癌的方法。如果我們通過手術能把整個實體瘤完全切除,那么腫瘤患者是可以治愈的。但是,目前肝癌患者手術切除后,五年復發(fā)率接近100%,5年生存率為5%。造成以上結果的主要原因有：1.現有的術前常規(guī)檢查手段CT、MRI、B超等,由于自身的分辨率的限制,對于直徑小于lcm的腫瘤難以有效的診斷,術前診斷、決策也容易忽略這類腫瘤診斷,術中未能切除,造成術后的復發(fā)轉移；2.在術中,醫(yī)生綜合術前影像學資料,術中的視診,觸診情況(腫瘤組織的色澤、形態(tài)、質地等)以及臨床經驗判斷腫瘤的位置和邊緣,難以客觀的評判腫瘤的位置和邊緣,醫(yī)師依靠主觀判斷切除腫瘤,因此,手術切緣是否有癌灶殘余,是否有微小轉移癌灶的殘留等問題就難以客觀的評判。腫瘤患者體內微小腫瘤殘余,手術切緣尚殘留腫瘤細胞(陽性切緣),那么患者術后腫瘤復發(fā),預后差的結局就在所難免。而且,對于術后復發(fā)的腫瘤患者,二次手術或者術后化療的效果也極其的有限。因此,外科醫(yī)師需要一種技術可以輔助臨床醫(yī)師發(fā)現微小腫瘤和精確定位腫瘤邊界,術中實時、準確、客觀的提供腫瘤位置和邊界,臨床醫(yī)師參考以上信息,在術中徹底的切除腫瘤,獲得陰性切緣,減少術后復發(fā)率,這對于提高腫瘤患者術后生存率,改善他患者的生活質量具有非常重要的意義。在臨床腫瘤治療方法研究中,自2008年日本醫(yī)生開始將光學分子影像手術導航系統應用于肝臟腫瘤切除手術后,術中實時熒光導航技術受到臨床醫(yī)生們的關注。與傳統的臨床成像系統相比,術中熒光成像擁有低成本、簡單容易、安全(比如沒有輻射)、實時、高分辨率,高靈敏度等優(yōu)勢,高分辨率以及高特異性識別更是它的優(yōu)勢。目前在臨床上研究比較成熟的熒光導航方法是基于吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)為熒光材料的近紅外熒光手術導航儀。這項技術已經應用于乳腺癌前哨淋巴結檢測、胃癌轉移淋巴結檢測、原位肝癌、肝癌轉移灶、結直腸癌肝轉移等外科手術。但是,由于ICG沒有主動靶向性,水穩(wěn)定性、易與脂蛋白結合導致在體內快速被肝臟清除(血漿中半衰期為2-4min)通過膽道系統、消化道以原型排出體外。使得腫瘤攝取ICG的量非常的有限,而且在肝臟腫瘤的應用中,其假陽性達到了40%-50%,這些都限制了ICG以及這種手術導航方法在其他腫瘤方面的研究與應用。為了克服這些困難,實現熒光手術導航方法更好的應用于腫瘤的診斷與治療,科學家們開始借助不同的分子探針,聯合磁共振、光學、核素和超聲等影像學技術,實現了對單個細胞、乃至與單個分子的非侵入式顯像；同時,主動靶向探針作為熒光手術導航介質的方法也是目前國際研究的熱點。在2010年,錢永健團隊應用熒光分子影像主動靶向探針ACPPDs在熒光手術導航儀的輔助下對裸鼠皮下乳腺癌腫瘤進行了熒光導航的切除,發(fā)現這種方法與傳統方法切除裸鼠皮下乳腺癌腫瘤相比,熒光手術導航組的裸鼠的腫瘤殘余率低,術后的生存率得到明顯的改善。在2013年,錢永健團隊應用ACPPDs對于乳腺癌淋巴結轉移的裸鼠進行研究,結果指出,這種主動靶向的熒光探針可以定位乳腺癌淋巴結轉移灶,并實時指導轉移淋巴結的切除。在2014年, Debadyuti Ghosh團隊,應用主動靶向探針SBP-M13-SWNT對亞毫米的卵巢癌腫瘤進行靶向診斷,并且進行了實時熒光手術導航。在臨床應用方面,在2013年,Matthew B. Sturm團隊應用主動靶向早期食管腫瘤的熒光探針ASY*-FITC完成了首例人體試驗,而且手術效果良好。在眾多光學成像方面,近紅外熒光成像是一種特殊類型的熒光,同時也是目前光學熒光成像中的一個重要發(fā)展趨勢,與常規(guī)光學相比,近紅外熒光(650 to 900 run)受生物組織本底的影響小,在生物組織內吸收衰減和散射小,從而具有組織中的穿透能力強、背景噪聲小和產生的信背比高。近紅外熒光手術導航儀具有以上優(yōu)勢,但在腫瘤診療應用中受制于沒有理想的近紅外熒光探針,所以近紅外熒光成像探針的研發(fā)一直是分子影像研究的挑戰(zhàn)。同樣的,具有腫瘤特異性靶向的近紅外熒光分子探針仍然缺乏。所以仍需要投入大量的科研來尋找更多的能夠用于近紅外熒光手術導航儀的熒光分子探針。在本實驗研究中,我們針對近紅外熒光手術導航下,手術切除肝臟腫瘤研究的熱點問題,利用具有良好生物相容性的多介孔二氧化硅(mesoporous silical nanoparticals,MSNs)硅球材料作為分子探針的載體,用ICG作為近紅外熒光染料,并用RGD多肽進行靶向修飾后構建成能夠主動靶向整合素螄p3受體的近紅外熒光探針,并建立人肝癌皮下腫瘤裸鼠模型、’人肝癌原位腫瘤裸鼠模型和人乳腺癌轉移性肝癌裸鼠模型,探討靶向探針的生物適應性,主動靶向性,靶向成像效果和術中實時熒光手術導航的應用價值。研究目的：本研究的目的是制備一種主動靶向整合素嘶β3受體的近紅外熒光納米探針,可以在術中實時的精確定位肝臟腫瘤的位置和邊界,為術者在術中實時提供客觀的手術切緣參考,實現精準的熒光手術導航切下切除腫瘤。研究方法：1.多介孔硅球的合成和觀察水熱合成法合成多介孔硅球,掃描電鏡和透射電鏡觀察多介孔硅球的形貌和大小；粒度儀檢測多介孔硅球的水合粒徑與粒徑分布特征。2.主動靶向探針的合成與化學表征將吲哚菁綠超聲震蕩上載入多介孔硅球中,聚乙二醇修飾后,加入RGD多肽溶液制備成主動靶向嘶β3受體的近紅外熒光納米探針(ICG/MSNs-RGD)。掃描電鏡和透射電鏡觀察靶向探針的形貌和大小,粒度儀檢測探針水合粒徑與分布；熒光分光光度計檢測靶向探針及ICG的發(fā)射光譜與激發(fā)光譜。3.探針毒性實驗、體外靶向探針靶向能力的觀察用MSNs和靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育HepG2肝癌細胞后,再用MTT法評估MSNs和靶向探針的毒性；將αvβ3受體高表達的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細胞和αvβ3受體低表達的MCF-7乳腺癌細胞分別用靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育1小時,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution, PBS)液沖洗干凈后,近紅外體式熒光顯微鏡觀察兩種細胞攝取靶向探針的情況；4.皮下肝臟腫瘤裸鼠模型,原位肝臟腫瘤裸鼠模型和乳腺癌肝轉移癌裸鼠模型的建立取20只5-6周雄性BALB/c裸鼠,取含1×107/mL HepG2-GFP細胞懸液接種于裸鼠左腋部皮下,建立裸鼠皮下肝臟腫瘤裸鼠模型。在無菌條件下麻醉裸鼠,經劍突下5 mm處豎直切口開腹部暴露肝臟,沿肝臟被膜下進針,緩慢推入50μL含1×107/mL HepG2-GFP或MDA-MB-231-GFP細胞懸液,逐層關腹,同樣方法建立10只5-6周雄性BALB/c裸鼠原位模型或10只5-6周雌性BALB/c乳腺癌肝臟轉移裸鼠模型。5.在體研究靶向探針的主動靶向功能取8只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型,隨機分成兩組(每組4只),一組為對照組,經尾靜脈注射非靶向探針(ICG/MSNs) 150μL (0.2 mg/mL);一組為靶向探針組,經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD) 150μL (0.2mg/mL)。在注射后的10min,12h,24h,48h,72h,96h和120h用IVIS 200分子影像系統觀察探針在體分布情況。其中,在24h時,每組分別取一只荷瘤裸鼠,脫頸處死,取腫瘤,心臟,肝臟,脾臟,腎臟等重要臟器,觀察探針在各重要臟器的分布情況。同時用IVIS活體成像軟件3.0分析腫瘤區(qū)域探針代謝數據并繪制曲線。6.探針在皮下肝腫瘤邊界的精準定位的應用取3只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型,經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,用近紅外體式熒光顯微鏡系統進行熒光手術導航定位腫瘤位置和邊界,同時用腫瘤自帶綠色熒光作為定位腫瘤位置和邊界的參考標準。術后將腫瘤標本切片后行HE染色,在病理切片水平,用近紅外體式熒光顯微鏡系統定位腫瘤邊界與HE染色結果對比,確定近紅外熒光導航系統在宏觀和微觀上均可以精準的定位腫瘤邊界。7.探針對于微小皮下肝臟腫瘤的手術導航的應用取12只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型,經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,分成兩組,每組6只,兩位臨床醫(yī)師在遵循最大限度的切除腫瘤的同時盡最大努力保留正常組織的條件下,分別對6只荷瘤裸鼠進行腫瘤切除,醫(yī)師在憑借視診、觸診的主觀判斷腫瘤已經切除完全后,用近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統對手術區(qū)域進行檢查,評估是否仍有微小腫瘤的殘余。如果有微小腫瘤的殘余,在近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統輔助下繼續(xù)進行腫瘤切除,直到腫瘤切除干凈。最后所有腫瘤標本均進行病理切片觀察。8.探針對于肝臟微小原位轉移灶的精確診斷及手術導航切除取原位肝癌裸鼠模型小鼠3只,經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,將小鼠麻醉,經腹正中線開腹暴露肝臟,在近紅外熒光手術導航系統導航下,輔助術者定位肝臟腫瘤位置和腫瘤邊界,完成肝臟原位腫瘤的手術切除,然后再行腹腔探查。9.探針對于肝臟轉移癌及腹腔轉移癌的診斷及手術導航切除取乳腺癌肝臟轉移裸鼠模型3只,經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD,150μL,0.2 mg/mL) 48h后,將小鼠麻醉,經腹正中線開腹暴露肝臟,在近紅外熒光手術導航系統導航下,輔助術者定位肝臟轉移癌位置和邊界,完成肝臟轉移癌的手術切除,然后再行腹腔探查。10.組織病理驗證將腫瘤組織利用冰凍切片包埋劑(optimum cutting temperature OCT)進行包埋和連續(xù)切片,然后將組織切片用蘇木素和伊紅(HE)染色法進行染色固定。11.統計學分析連續(xù)變量采用均數±標準差(mean±SD)表示,兩組組間整體比較采用重復測量資料的方差分析；單因素組內比較采用完全隨機設計資料的方差分析；單個時間點比較應用兩獨立樣本的t檢驗。數據分析應用IBM SPSS 19.0軟件進行分析, P0.05認為差異有統計學意義,繪圖及表格軟件應用Prim 5.0.研究結果：1.介孔硅球呈規(guī)則的球形,粒徑約為100nnm,分散性良好。靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD保持規(guī)格的球形,粒徑約為100nm,分散性良好；激發(fā)波長(780nnm)和發(fā)射波長(837nm)；與ICG相比,發(fā)生了3-4nm的紅移。2.MTT毒性實驗結果表明MSNs和靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD具有良好的生物相容性；體外靶向探針特異性評估實驗中,在近紅外體式熒光顯微鏡觀察到探針I(yè)CG/MSNs-RGD孵育后的αvβ3受體高表達的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細胞內熒光強度比αvβ3受體低表達的MCF-7乳腺癌細胞內強,MDA-MB-231-GFP細胞攝取了更多的探針I(yè)CG/MSNs-RGD.3.在體靶向探針代謝實驗中,探針組皮下荷瘤裸鼠在注射探針10min,12h,24h,48h,72h,96h和120h后,腫瘤區(qū)域的熒光值隨著時間的推移逐漸消退,腫瘤區(qū)域與周圍正常組織的熒光強度對比值在48h時最大(4.92±0.2),可以選擇為最佳手術時間點。在離體腫瘤和器官水平上,可見探針主要分布在腫瘤區(qū)域。4.靶向探針在術中可以給術者提供清晰的腫瘤位置和腫瘤邊界,為術者提供一個客觀的腫瘤邊界參考。5.在探針對于微小皮下肝臟腫瘤的手術導航的應用實驗中,兩位手術醫(yī)師都可以定位和切除直徑為5.01±2.08 mm的大腫瘤。通過近紅外體式熒光顯微鏡的輔助,兩位醫(yī)師分別發(fā)現肉眼無法發(fā)現的微小殘余癌癥2個和3個,直徑在0.95±0.07mm。切除的總共腫瘤數目為17個,HE染色確定均為腫瘤組織。6.在探針對于原位肝癌裸鼠模型的實驗中,經尾靜脈注射靶向探針48h后,經腹正中線開腹暴露肝臟,并用近紅外體式熒光導航系統輔助術者切除腫瘤,5.09±2.31 mm大小的腫瘤肉眼均能判斷,但是0.4±0.21mm微小轉移灶通過導航系統能夠判斷,與周圍正常組織的對比度(Tumor to background, TBR)為4.7±0.21。在應用近紅外體式熒光導航系統對腹腔進行探測,發(fā)現肉眼未能發(fā)現的微小癌灶有5個,大小約為lmm,腫瘤區(qū)域與正常組織的對比度為TBR=5.23±0.82。7.同樣,在乳腺癌肝臟轉移模型中,經尾靜脈注射靶向探針48h后,經腹正中線開腹暴露肝臟,并用近紅外體式熒光導航系統輔助術者切除腫瘤,對于乳腺癌肝轉移的腫瘤模型,探針在整個腫瘤內積聚。提供給術者一個清晰的腫瘤定位和腫瘤邊界。研究結論：合成的主動靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光探針,具有良好的生物適應性,對整合素αvβ3受體具有良好的特異靶向性；在手術過程中實時的輔助術者精準定位腫瘤位置和邊界,同時提供良好的信背比。輔助術者在手術中準確定位腫瘤邊界和實時的定位亞毫米微小腫瘤(原位腫瘤或轉移腫瘤)；給術者提供一個實時的、客觀的腫瘤邊界和手術切緣的參考,輔助徹底的切除腫瘤。
【關鍵詞】：熒光導航手術 近紅外多介孔硅球 腫瘤靶向 微小腫瘤成像
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-23
• 一、引言23-27
• 二、材料和方法27-40
• 三、結果40-58
• 四、討論58-61
• 五、結論61-62
• 參考文獻62-68
• 附錄：中英文縮略詞對照表68-69
• 碩士研究生期間發(fā)表論文69-70
• 致謝70-72

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本文編號：719035