本文關鍵詞：羧基化單壁碳納米管致大鼠肝、肺、腎纖維化作用及其分子機制的初步研究

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【摘要】：單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotubes,S WNTs)是由單層石墨卷曲而成的一維管形碳納米材料。SWNTs具備系列優(yōu)越的光學、電學等理化性質(zhì),在納米藥物載體、近紅外熒光成像、疾病診斷以及腫瘤光熱治療等生物醫(yī)學方面的應用潛力很大,相關的研究是當前國際上重要的研究熱點之一。近年來,人們在SWNTs的生物醫(yī)學應用領域開展了大量的研究工作,取得了令人矚目的研究成果。隨著SWNTs在各個領域的廣泛研究和應用,它的潛在生物毒性越來越受到人們的關注,研究人員從動物、細胞和分子水平上對其生物毒性進行了大量的實驗研究。由于SWNTs屬于超細微顆粒,易分散到大氣環(huán)境中被呼吸道吸入,因此目前經(jīng)氣管滴注SWNTs引起的肺臟毒性作用及其機制的研究是其中最受關注和文獻報道最多的。然而,無論作為藥物載體,還是應用于體內(nèi)近紅外熒光成像進行疾病診斷,SWNTs的給藥方式均以靜脈注射為主。大量研究表明,SWNTs進入血液循環(huán)系統(tǒng)以后,主要積聚于肝、腎和肺。因此,研究靜脈注射的SWNTs對肝、腎和肺的致纖維化等毒性作用,不僅能夠為SWNTs的生物醫(yī)學應用提供毒性依據(jù),而且有助于進一步對SWNTs進行修飾以改善其生物兼容性。目的：1、評價尾靜脈注射羧基化單壁碳納米管(SWNT-COOH)對SD大鼠肝、肺和腎的致纖維化作用。2、利用熒光定量PCR研究SWNT-COOH誘導的大鼠肝纖維化作用的相關基因mRNA的表達。3、通過免疫組織化學實驗進一步探討SWNT-COOH誘導的大鼠肝纖維化作用相關蛋白的表達情況。4、評價尾靜脈注射SWNT-COOH對大鼠肺臟和腎臟的致纖維化作用,研究相關蛋白的表達。方法：1、WNT-COOH的制備和動物實驗前表征：依次以混合強酸(濃硝酸和濃硫酸)加熱氧化、以超聲振蕩剪切SWNTs,制備在水中分散性良好的SWNT-COOH,經(jīng)透析除雜、超濾濃縮和Co60-γ射線輻照消毒,備用。以透射電子顯微鏡(TEM)和激光納米粒度分析儀(LPSA)分別觀測和測定SWNT-COOH的形貌和粒徑大小,以電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測SWNT-COOH分散液中的金屬含量,以紫外-可見分光光度計(UV-Vis)測定SWNT-COOH的濃度。2、實驗分組和周期設定：取SD大鼠96只,隨機分為兩組,即空白對照組和SWNT-COOH實驗組,每組均為雌雄各半,尾靜脈注謝給藥；設定1月、2月、3月和4月共4個周期,其中4月周期為給藥3個月后停藥1個月。每天觀察和記錄大鼠的存活情況,每周稱量一次大鼠的體重并做好記錄。每個周期結束時,每組隨機抽取12只大鼠、雌雄各半,共24只,麻醉解剖,采集標本。3. SWNT-COOH誘導的SD大鼠纖維化作用：采用蘇木素-伊紅染色法(HE染色法)評價SWNT-COOH引起的大鼠肝、肺、腎的病理變化；利用TEM觀測和研究SWNT-COOH對大鼠肝臟細胞超微結構的影響。4、應用實時熒光定量PCR (qPCR)分別測試、分析空白對照組和SWNT-COOH給藥組的大鼠肝組織中肝纖維化相關基因mRNA的表達情況：包括平滑肌激動蛋白α2 (ACTA-2)、轉化生長因子-β (TGF-β)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原蛋白(Col Ⅲ)等。5、應用免疫組織化學法分別檢測、分析空白對照組和SWNT-COOH給藥組的大鼠肝、肺、腎組織中肝纖維化相關蛋白的表達情況：包括平滑肌激動蛋白α2 (ACTA-2)、轉化生長因子-β(TGF-β)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(Col Ⅲ)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)的表達。結果：1、經(jīng)氧化、剪切和純化后,SWNT-COOH在水中具有較好的分散性,TEM觀測和LPSA測試表明,SWNT-COOH的粒徑分布比較均一,團聚較少；SWNT-COOH的Z均粒徑為94.7nm,明顯變短。ICP-OES測試結果表明,用于動物實驗的SWNT-COOH樣品的Fe、Co、 Al、Cr、Cu、Ni等金屬含量均較低。2、與空白對照組相比,SWNT-COOH給藥組的SD大鼠在2月周期死亡2只,4月周期時死亡1只,因此,給藥組累積死亡3只,死亡的大鼠出現(xiàn)明顯的腹部腫脹,解剖可見腹部積水。隨著給藥周期的增加,大鼠肝臟和肺臟黑染加深,大量SWNT-COOH在肝臟和肺臟沉積,停止給藥1個月后,黑染變淺。3、大鼠肝臟切片經(jīng)HE染色,在光學顯微鏡下觀察可見SWNT-COOH給藥組匯管區(qū)血管周圍炎癥細胞浸潤,并伴隨纖維化,并隨給藥周期增加而加劇,呈周期依賴性。大鼠肝臟切片的TEM結果表明,空白對照組細胞核仁明顯,細胞器豐富,邊緣清晰；而給藥組細胞內(nèi)線粒體受損,胞漿區(qū)出現(xiàn)大量空泡,溶酶體內(nèi)可見SWNT-COOH,細胞間可觀察到膠原纖維束。4、實時qPCR表明,與空白對照組相比,SWNT-COOH給藥組的肝纖維化相關基因ACTA-2、TGF-p、 Col I和Col III的mRNA表達水平顯著上調(diào)。5、免疫組織化學染色檢測和分析結果表明,與空白對照組相比,SWNT-COOH給藥組的大鼠肝臟、肺臟和腎臟等組織的纖維化相關蛋白ACT-2、TGF-β、Col Ⅰ. Col Ⅲ、MMP-2和TIMP-2蛋白表達均上調(diào)。結論：1、SWNT-COOH具有損傷大鼠肝、肺和腎等臟器組織,并誘導纖維化的生物毒性作用。2、其可能機制為,SWNT-COOH大量沉積于大鼠肝、肺和腎,被這些組織細胞吞噬,損傷線粒體和溶酶體,引發(fā)慢性炎癥,上調(diào)纖維化相關基因和蛋白表達,導致纖維化的發(fā)生。
【關鍵詞】：羧基化單壁碳納米管 大鼠 肝臟 纖維化 分子機制
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TB383.1;R114
【目錄】：

• 主要英文縮略語表5-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-18
• 參考文獻16-18
• 第一章 羧基化單壁碳納米管的制備與表征18-29
• 1 材料19-20
• 2 實驗方法20-22
• 3 結果22-25
• 4 討論25-26
• 5 結論26-27
• 參考文獻27-29
• 第二章 羧基化單壁碳納米管誘導大鼠肝臟纖維化的作用29-46
• 1 材料30-31
• 2 實驗方法31-34
• 3 結果34-42
• 4 討論42-44
• 5 結論44-45
• 參考文獻45-46
• 第三章 羧基化單壁碳納米管誘導肝纖維化的機制46-64
• 1 材料46-48
• 2 實驗方法48-54
• 3 結果54-61
• 4 討論61-63
• 5 結論63
• 參考文獻63-64
• 第四章 羧基化單壁碳納米管致大鼠肺、腎纖維化的初步研究64-85
• 1 材料64-65
• 2 實驗方法65-68
• 3 結果68-81
• 4 討論81-82
• 5 結論82-83
• 總結83-84
• 參考文獻84-85
• 綜述85-96
• 參考文獻93-96
• 致謝96-97
• 攻讀碩士學位期間(待)發(fā)表的論文97

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：670454