本文關(guān)鍵詞：1-溴丙烷致大鼠大腦神經(jīng)元凋亡及其機(jī)制探討

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【摘要】：研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)作為一種臭氧層消耗溶劑如氯氟烴類和某些致癌物如三氯乙烯、三氯甲烷、四氯乙烯的替代劑而廣泛地應(yīng)用于工作場(chǎng)所中,主要用途是作為金屬、電子元件、光學(xué)儀器的清洗劑等。研究顯示1-BP能導(dǎo)致健康損傷,呈現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system, PNS)毒性如導(dǎo)致感覺和運(yùn)動(dòng)損傷以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)毒性如引起抑郁、焦慮和認(rèn)知損傷。1-BP中毒病例從1999年至今在美國(guó)、日本等地陸續(xù)報(bào)道,與其它的神經(jīng)毒性有機(jī)溶劑如正己烷導(dǎo)致的神經(jīng)中毒病例相比,1-BP中毒病人更多地表現(xiàn)出CNS毒性癥狀。迄今為止,1-BP導(dǎo)致CNS損傷的初始靶點(diǎn)和早期關(guān)鍵事件尚未明確。研究顯示在人類慢性神經(jīng)退行性疾病的起始和進(jìn)展過(guò)程中,病變大腦中持續(xù)存在著逐漸加重的慢性炎癥反應(yīng),被認(rèn)為與退行性病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在環(huán)境神經(jīng)毒物誘導(dǎo)損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦中也觀察到明顯的炎性變化。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AS)作為大腦內(nèi)炎性反應(yīng)的主要介導(dǎo)者,其功能失調(diào)在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。但炎性反應(yīng)是否是1-BP的主要神經(jīng)毒性機(jī)制尚未見報(bào)道。近年來(lái)的研究顯示,二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)具有很強(qiáng)的抗炎活性,且能穿越血腦屏障,膳食補(bǔ)充DHA能夠明顯提高大腦中DHA水平,如若補(bǔ)充DHA能夠減輕1-BP的神經(jīng)毒性反應(yīng)可提示1-BP的神經(jīng)毒性與腦內(nèi)的炎性反應(yīng)相關(guān)。同時(shí),吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)是炎性通路中關(guān)鍵信號(hào)分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor κB, NF-κB)的特異性抑制劑,抑制NF-κB激活、阻斷炎性反應(yīng)若能夠有效逆轉(zhuǎn)1-BP的神經(jīng)毒性,可證實(shí)炎性反應(yīng)在1-BP神經(jīng)毒性機(jī)制中的作用。因此,本研究采用經(jīng)口染毒途徑,首先觀察了1-BP對(duì)雄性Wistar大鼠大腦神經(jīng)元損傷以及腦內(nèi)炎性變化的劑量效應(yīng)關(guān)系；進(jìn)而分別采用具有抗炎作用的DHA和NF-κB阻斷劑,觀察了對(duì)1-BP導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的逆轉(zhuǎn)情況,從炎癥角度來(lái)評(píng)價(jià)1-BP的CNS毒性及其毒性機(jī)制,以期為1-BP以及其它有機(jī)溶劑神經(jīng)毒性的防控及有效治療提供理論參考依據(jù)。研究方法11-BP致大鼠大腦損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、100、200、400、800mg/kg·bw 1-BP劑量組,每組12只。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后,將1-BP溶于玉米油,經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)劑量的1-BP,對(duì)照組經(jīng)口灌胃給予等體積的玉米油,每天1次,連續(xù)13天。病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)：每組隨機(jī)選取4只動(dòng)物麻醉后,行心臟灌注,制備大腦冰凍切片,分別進(jìn)行免疫組化和TUNEL染色。免疫熒光雙染色觀察大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex, PFC)中神經(jīng)元和AS的變化情況,TUNEL染色檢測(cè)PFC中細(xì)胞的凋亡。Western blot:水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日晨,斷頭處死大鼠,迅速分離大鼠大腦PFC和海馬(hippocampus, HPC),制備組織勻漿,15,000g、4℃離心30min。采用Western blot方法檢測(cè)PFC中活化的caspase-3、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神經(jīng)元核蛋白(neuron nuclear protein, NeuN)、糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)和蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)的蛋白含量變化。ROS含量測(cè)定：大鼠大腦PFC冰凍勻漿,采用二氯熒光素二乙酸作為熒光染料檢測(cè)PFC中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的含量。COX-2 mRNA含量測(cè)定：采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)大鼠大腦PFC中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA含量。2補(bǔ)充DHA對(duì)1-BP神經(jīng)毒性的影響神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)：60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、1-BP組、1-BP+250mg/kg·bw DHA組和1-BP+500mg/kg·bw DHA組,每組15只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1-BP溶于玉米油,經(jīng)灌胃給予1-BP組、DHA干預(yù)組800mg/kg·bw的1-BP,每天1次,連續(xù)13天。DHA溶于玉米油,在1-BP染毒前7天經(jīng)口灌胃分別給予250mg/kg·bw DHA組、500mg/kg·bw DHA組相應(yīng)劑量的DHA,每天1次,連續(xù)20天。當(dāng)DHA和1-BP需要共同給予時(shí),DHA在1-BP染毒前4小時(shí)給予。對(duì)照組和1-BP組大鼠給予等體積的玉米油。定期測(cè)量大鼠體重,調(diào)整動(dòng)物灌胃量,1-BP染毒后7天,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)：每組隨機(jī)選取4只動(dòng)物麻醉后,行心臟灌注,制備石蠟切片,采用尼氏染色觀察大鼠大腦PFC和HPC神經(jīng)元損傷情況,TUNEL染色檢測(cè)PFC和HPC中神經(jīng)元凋亡。Western blot:水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日晨,斷頭處死大鼠,迅速分離大腦PFC和HPC,制備組織勻漿,15,000g、4℃離心30min。利用Western blot方法分別測(cè)定大鼠大腦PFC和HPC中凋亡相關(guān)蛋白,包括細(xì)胞色素C (cytochrome c, cyt c)、活化的caspase-3、Bcl-2和Bax；4-HNE和arcolein氧化蛋白加合物以及失活型的(即磷酸化的)GSK-3p和Akt蛋白含量的變化。3PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)1-BP炎性反應(yīng)及神經(jīng)毒性的影響神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)：48只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、800mg/kg·bw 1-BP組、100mg/kg·bw PDTC組、100mg/kg·bw PDTC+800mg/kg bw 1-BP組,1-BP溶于玉米油經(jīng)口灌胃,PDTC溶于生理鹽水提前1小時(shí)腹腔注射,對(duì)照組和PDTC組給予等體積的玉米油,每天1次,連續(xù)13天。1-BP染毒7天后,動(dòng)物進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)：每組隨機(jī)選取4只動(dòng)物麻醉后,行心臟灌注,制備冰凍切片,免疫熒光雙染色觀察大鼠大腦PFC中神經(jīng)元和AS的變化情況以及TUNEL染色檢測(cè)PFC中細(xì)胞的凋亡。Western blot:水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日晨,斷頭處死大鼠,迅速分離大鼠大腦PFC,制備組織勻漿,15,000g、4℃離心30min。利用Western blot方法測(cè)定PFC中活化的caspase-3、GFAP、NeuN、GSK-3β和Akt的蛋白含量變化。ROS含量測(cè)定：大鼠大腦PFC冰凍勻漿,采用二氯熒光素二乙酸作為熒光染料檢測(cè)PFC中ROS的含量。COX-2 mRNA含量測(cè)定：采用qRT-PCR測(cè)定大鼠大腦PFC中COX-2的mRNA含量。研究結(jié)果1 1-BP致大鼠大腦損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系1.1 1-BP染毒大鼠大腦PFC病理形態(tài)學(xué)改變與對(duì)照組相比,免疫熒光雙染色顯示1-BP組染毒大鼠大腦PFC中AS活化并伴隨神經(jīng)元減少；TUNEL染色顯示大鼠大腦PFC中神經(jīng)元凋亡增加,均表現(xiàn)為劑量效應(yīng)。1.2 1-BP染毒大鼠大腦炎性反應(yīng)的劑量效應(yīng)關(guān)系與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠大腦PFC中ROS含量呈劑量依賴性升高(p0.05)。1-BP染毒組大鼠大腦PFC中COX-2 mRNA含量也表現(xiàn)為劑量依賴性地升高(p0.05)1.3 1-BP染毒大鼠PFC中各檢測(cè)蛋白質(zhì)的含量變化與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠活化的caspase-3和GFAP的蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性升高(p0.05),NeuN的蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性降低(p0.05),與免疫組織化學(xué)結(jié)果符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1-BP染毒大鼠大腦的p-GSK-3p和p-Akt的蛋白表達(dá)量均呈劑量依賴性升高(p0.05)。2 補(bǔ)充DHA對(duì)1-BP神經(jīng)毒性的影響2.1 補(bǔ)充DHA對(duì)1-BP染毒大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行其逃避潛伏期和游泳距離都呈下降趨勢(shì),下降趨勢(shì)在各組間沒有差別(p0.05)。與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠的逃避潛伏期和游泳距離明顯增加(p0.05),而穿越平臺(tái)的次數(shù)減少(p0.01)。與1-BP染毒組相比,補(bǔ)充DHA后,1-BP染毒大鼠的逃避潛伏期和游泳距離明顯降低,呈劑量依賴性(p0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)增加(p0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳速度沒有明顯差別(p0.05),提示以上各種指標(biāo)的差別非運(yùn)動(dòng)能力受損造成。2.2補(bǔ)充DHA對(duì)1-BP染毒大鼠大腦PFC和HPC病理形態(tài)學(xué)的影響在大鼠大腦PFC和HPC的CA3區(qū),1-BP染毒導(dǎo)致神經(jīng)元尼氏體密度降低,椎體細(xì)胞空泡化,而補(bǔ)充DHA能明顯改善神經(jīng)元的病理形態(tài)學(xué)變化。采用TUNEL染色檢測(cè)大腦神經(jīng)元的凋亡,結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠大腦幾乎沒有凋亡陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),而1-BP染毒大鼠大腦PFC和HPC的CA3區(qū)出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,補(bǔ)充DHA組大鼠神經(jīng)元凋亡明顯減少。2.3補(bǔ)充DHA對(duì)1-BP染毒大鼠大腦PFC和HPC中各檢測(cè)蛋白質(zhì)的影響與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠PFC和HPC中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(p0.05),cyt c、Bax、活化caspase-3和Bax/Bcl-2的比例顯著上調(diào)(p0.05)磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)和磷酸化的Akt (p-Akt)蛋白表達(dá)量顯著升高(p0.05),4-HNE和acrolein蛋白加合物表達(dá)量顯著上升(p0.05)。而與1-BP組相比,補(bǔ)充DHA后明顯逆轉(zhuǎn)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；p-GSK-3β和p-Akt表達(dá)升高也得到糾正,4-HNE和acrolein蛋白加合物的含量亦明顯降低(p0.05)。3PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)1-BP炎性反應(yīng)及神經(jīng)毒性的影響3.1 PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)大鼠大腦PFC病理形態(tài)學(xué)的影響與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠大腦PFC中AS明顯活化并伴隨神經(jīng)元的減少。TUNEL染色顯示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞增多,而PDTC阻斷NF-κB激活明顯降低了AS活化、神經(jīng)元減少以及神經(jīng)元凋亡。3.2 PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)大鼠大腦PFC炎性反應(yīng)的影響與1-BP相比,PDTC阻斷NF-κB激活明顯降低了大腦PFC中ROS的含量(p0.05),同時(shí)PDTC阻斷NF-κB激活后也明顯降低了COX-2 mRNA的含量(p0.05)。3.3 PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)大鼠大腦PFC中各檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的影響與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠活化的caspase-3和GFAP的蛋白表達(dá)量顯著升高(p0.05),NeuN的蛋白表達(dá)量顯著降低(p0.05),p-GSK-3β和p-Akt的蛋白表達(dá)量顯著升高p0.05)。而與1-BP組相比,PDTC阻斷NF-κB激活顯著降低了大鼠大腦PFC中活化caspase-3和GFAP的蛋白表達(dá)量(p0.05),增加了NeuN的蛋白表達(dá)量(p0.05),降低了p-GSK-3β和p-Akt的蛋白表達(dá)量(p0.05)3.4 PDTC阻斷NF-κB激活對(duì)1-BP染毒大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行其逃避潛伏期和游泳距離都呈下降趨勢(shì),并且這種下降趨勢(shì)組間沒有差別(p0.05)。與對(duì)照組相比,1-BP組染毒大鼠的逃避潛伏期和游泳距離增加(p0.05),而穿越平臺(tái)的次數(shù)減少(p0.01)。與1-BP染毒組相比,PDTC阻斷NF-κB激活,實(shí)驗(yàn)大鼠的逃避潛伏期和游泳距離(p0.05)均明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(p0.05)。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳速度沒有明顯差別(p0.05),提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的差別并非由運(yùn)動(dòng)能力損傷導(dǎo)致。結(jié)論1.大腦是1-BP神經(jīng)毒作用敏感的靶器官,1-BP可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶相關(guān)區(qū)域神經(jīng)元減少,動(dòng)物認(rèn)知功能障礙。2.1-BP導(dǎo)致的大腦損傷可能與大腦AS活化、腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)及GSK-3β的失活有關(guān)。3.采用DHA和PDTC抑制腦內(nèi)的炎性反應(yīng)能夠減輕1-BP的中樞神經(jīng)毒性。
【關(guān)鍵詞】：1-溴丙烷 二十二碳六烯酸 吡咯烷二硫代氨基甲酸銨 星形膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)元凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 符號(hào)說(shuō)明18-20
• 前言20-25
• 材料與方法25-39
• 結(jié)果39-52
• 討論52-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄74-75
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表75

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本文編號(hào)：589767