本文關(guān)鍵詞：小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Regnase-1負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)損傷

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【摘要】：研究背景免疫反應(yīng)的合理調(diào)控對(duì)于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。然而,當(dāng)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)失去平衡時(shí),過度的神經(jīng)炎癥就會(huì)產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞和組織造成損傷。越來越多的研究表明,神經(jīng)炎癥參與眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程,這些疾病包括缺血性腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病如帕金森病(Parkinson' sdisease,PD)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等。因此,以神經(jīng)炎癥的調(diào)控為切入點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究有助于加深對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病病理過程的理解,同時(shí)也有益于發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病的新治療靶點(diǎn)。危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)的出現(xiàn)作為組織和細(xì)胞受損的信號(hào)被認(rèn)為是一種警報(bào)素,預(yù)警著損傷發(fā)生的同時(shí)又進(jìn)一步介導(dǎo)一系列無菌性炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,從而在適應(yīng)性免疫和固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。高遷移率蛋白B-1(high mobility group-1 protein, HMGB1)是DAMPs中的重要一員,正常情況下大部分HMGB1作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi),當(dāng)有病原體的刺激或者組織的損傷出現(xiàn)時(shí),HMGB1將會(huì)被主動(dòng)或者被動(dòng)的釋放至胞外,進(jìn)而與免疫細(xì)胞表面相應(yīng)的模式識(shí)別受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。HMGB1的釋放存在于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中,這些疾病包括缺血性腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷、AD. PD和MS等。細(xì)胞外的HMGB1與小膠質(zhì)細(xì)胞或者浸潤(rùn)在受損組織中的巨噬細(xì)胞表面的糖基化終末產(chǎn)物受體(the Receptor of Advanced Glycation Endproducts, RAGE)、Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)-2. TLR-4或者巨噬細(xì)胞表面分子抗原(macrophage antigen complex 1, Macl)等受體結(jié)合,募集核內(nèi)的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),隨后誘導(dǎo)核因子-κB (Nuclear Factor-κB, NF-κB)合成并釋放一系列炎癥因子,最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷。與此同時(shí),被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和受損的神經(jīng)元又可以進(jìn)一步主動(dòng)或者被動(dòng)的釋放HMGB1從而引起新一輪炎癥因子的釋放,加重對(duì)神經(jīng)和血管組織造成的炎性損傷,因此而形成一個(gè)惡性循環(huán),推進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來有關(guān)HMGB1促炎作用的研究越來越深入,然而,針對(duì)HMGB1所介導(dǎo)炎癥過程的負(fù)性調(diào)控機(jī)制還所知甚少。調(diào)節(jié)性RNA酶-1(regulatory RNase-1, Regnase-1),又名Zc3h12a或者單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein, MCPIP),是一個(gè)具有內(nèi)切酶活性的CCCH型鋅指蛋白。Regnase-1可以通過特異性識(shí)別炎癥因子mRNA3'端非編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)降來解炎癥因子的mRNA,這些炎癥因子包括括白介素(interleukin, IL)-1β/2/6/12β,干擾素-γ (interferon-γ, IF-γ)等。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein l,MCP-1),脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和IL-1β被證實(shí)可以通過NF-κB或MAPK信號(hào)通路引起Regnase-1的有效轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Regnase-1被報(bào)道參與電針預(yù)刺激誘導(dǎo)的大腦缺血耐受效應(yīng)和二甲胺四環(huán)素針對(duì)缺血性卒中損傷產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。除此之外,Regnase-1可通過調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)參與LPS介導(dǎo)的大腦缺血耐受。而有關(guān)微小核糖核酸(microRNA, miRNA)-9可通過抑制Regnase-1從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞的研究進(jìn)一步說明了Regnase-1具有潛在的炎癥調(diào)控作用。綜合以上研究結(jié)果,我們可以推測(cè)Regnase-1具有減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥損傷的潛力。因此,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,綜合HMGB1的促炎作用和Regnase-1抑制炎癥的潛力,再加之考慮到Regnase-1的生成過程和HMGB1的促炎過程均涉及NF-κB和MAPK等信號(hào)通路,由此我們提出假說——Regnase-1可被HMGB1誘導(dǎo)表達(dá)從而負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1介導(dǎo)的炎癥過程和神經(jīng)損傷作用。本研究將以中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的炎癥細(xì)胞之一——小膠質(zhì)細(xì)胞做為研究對(duì)象,通過一些列實(shí)驗(yàn)探究HMGB1是否能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Regnase-1的表達(dá)增加,并通過功能缺失的實(shí)驗(yàn)方法研究Regnase-1是否對(duì)HMGB1介導(dǎo)的炎癥具有負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)；最后,通過探究HMGB1刺激下Regnase-1對(duì)神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用去評(píng)價(jià)Regnase-1在神經(jīng)炎癥損傷過程中對(duì)神經(jīng)組織的保護(hù)潛力。研究目的1.明確HMGB1刺激下BV2細(xì)胞(小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株)炎癥因子的表達(dá)變化情況。2.明確HMGB1的刺激是否誘導(dǎo)Regnase-1在BV-2細(xì)胞中表達(dá)增加。3.明確HMGB1的刺激是否誘導(dǎo)Regnase-1在大鼠腦內(nèi)表達(dá)增加,并明確其表達(dá)與小膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況。4.在HMGB1刺激下,Regnase-1的敲低是否使BV-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步增加并加重HMGB1誘導(dǎo)的炎癥對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷作用。研究方法1.檢測(cè)HMGB1刺激下,BV-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化使用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2,95%空氣)BV-2細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度到達(dá)約80%時(shí),使用不同濃度的HMGB1(0,0.1,0.5及1 u g/ml)分別刺激BV-2細(xì)胞24小時(shí),另外使用HMGB1(1 μg/ml)分別刺激BV-2細(xì)胞0,4,12及24小時(shí),采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)炎癥因子11-1β, IL-6和腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-α, TNF-α) mRNA的表達(dá)水平,明確HMGB1刺激下BV-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化。2.檢測(cè)HMGB1刺激下,BV-2細(xì)胞Regnase-1的表達(dá)變化使用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2,95%空氣)BV-2細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度到達(dá)約80%時(shí),使用HMGB1(1μg/ml)分別刺激細(xì)胞0,4,12及24小時(shí)。另外用不同濃度的HMGB1(0,0.1,0.5及1μg/ml)分別刺激BV-2細(xì)胞24小時(shí)。最后采用qPCR的方法檢測(cè)Regnase-1 mRNA的表達(dá)水平,明確HMGB1刺激下BV-2細(xì)胞Regnase-1的表達(dá)變化。3.檢測(cè)HMGB1刺激大鼠鼠腦后Regnase-1在腦內(nèi)的表達(dá)情況分別向Wistar大鼠右側(cè)側(cè)腦室注射HMGB1(8μg/kg)或生理鹽水(對(duì)照組),24小時(shí)后麻醉大鼠,用PBS進(jìn)行心臟灌注。(1)取出腦組織,分別提取兩組大鼠腦蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western blot),檢測(cè)并對(duì)比兩組大鼠腦內(nèi)Regnase-1蛋白的表達(dá)。(2)使用4%甲醛灌注固定鼠腦,取出腦組織使用不同濃度蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片,采用免疫組化觀察兩組大鼠鼠腦Regnase-1的表達(dá),采用免疫熒光檢測(cè)Regnase-1與小膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況。4. HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的表達(dá)變化將Regnase-1特異性siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞(si-Zc3hl2a組),錯(cuò)義序列siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照(siControl組)。轉(zhuǎn)染后使用相同濃度的HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2細(xì)胞1小時(shí),提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行qPCR特異性擴(kuò)增Regnase-1以及炎癥因子IL-13、IL-6、TNF-α的cDNA,和對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比顯示Regnase-1和炎癥因子的表達(dá)變化。采用Western blot和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV2細(xì)胞后,I1-1β蛋白的表達(dá)和分泌變化。5.HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞,檢測(cè)其上清對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)分為兩組,si-Zc3hl2a組(敲低Regnase-1組)及si-Control組(對(duì)照組),兩組BV-2細(xì)胞完成轉(zhuǎn)染后,用HMGB1 (1μg/ml)刺激細(xì)胞1小時(shí),收集細(xì)胞上清。將細(xì)胞上清與SH-SY5Y細(xì)胞(神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株)共孵育8,12或24小時(shí)后,采用CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit, CCK-8)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性,并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)；采用Annexin V-FITC/PI染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞的死亡率。6.統(tǒng)計(jì)分析本研究全部數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；多組間比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)采用Turkey法,當(dāng)方差不齊時(shí)采用Dunnett'T3法；兩因素比較時(shí)采用two-way ANOVA,方差齊時(shí)采用Turkey法,當(dāng)方差不齊時(shí)采用Dunnett'T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.不同濃度的HMGB1(0.1,0.5和1μ g/ml)刺激BV-2細(xì)胞24小時(shí),IL-1 β、IL-6和TNF-α表達(dá)均升高,且呈劑量依賴性。HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2細(xì)胞不同時(shí)間(0、4、12和24小時(shí)),4小時(shí)后IL-1 β和IL-6的mRNA表達(dá)至高峰,且直至24小時(shí)仍有表達(dá)升高；TNF-α mRNA水平的升高表現(xiàn)為雙向模式。2.不同濃度的HMGBl (0.1,0.5和1μg/ml)刺激BV-2細(xì)胞24小時(shí),Reganse-1的表達(dá)升高,且呈劑量依賴性。HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2細(xì)胞不同時(shí)間(0、4、12和24小時(shí)),4小時(shí)后Regnase-1的mRNA表達(dá)至高峰,且直至24小時(shí)仍有表達(dá)升高。3. Western blot和免疫組化的結(jié)果表明,側(cè)腦室注射HMGB1組的大鼠鼠腦較對(duì)照組的Regnase-1蛋白表達(dá)增多。免疫熒光顯示HMGB1刺激后,大鼠腦內(nèi)表達(dá)增多的Regnase-1與小膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位。4. qPCR結(jié)果顯示敲低Regnase-1后,HMGB1刺激BV-2細(xì)胞1小時(shí),IL-1 β、IL-6的mRNA表達(dá)較未敲低組表達(dá)增高(P＜0.05)。Western blot和ELISA結(jié)果顯示敲低Regnase-1后,HMGB1刺激BV-2細(xì)胞1小時(shí),IL-1 β的蛋白表達(dá)和分泌較未敲低組增高。5.HMGB1刺激敲低或未敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞后收集細(xì)胞上清,然后將細(xì)胞上清與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育8、12或24小時(shí),CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果和光學(xué)顯微鏡下的觀察均顯示,對(duì)比未敲低組,敲低Regnase-1后的細(xì)胞上清孵育SH-SY5Y細(xì)胞12小時(shí)后細(xì)胞活性更低(P0.05)。Annexin V-FITC/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,對(duì)比未敲低組,敲低Regnase-1后的細(xì)胞上清孵育SH-SY5Y細(xì)胞12小時(shí)后細(xì)胞死亡率更高(P(0.05)。結(jié)論1.本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證明了HMGB1誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2細(xì)胞的Regnase-1表達(dá)增加,同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了HMGB1誘導(dǎo)Regnase-1表達(dá)增加且與小膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位,可為HMGB1介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)疾病的研究提供研究基礎(chǔ)。2. Regnase-1負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1刺激下BV-2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá),HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞后,IL-1β、IL-6表達(dá)進(jìn)一步增加,證明了小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Regnase-1參與負(fù)性調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。3. HMGB1刺激敲低Regnase-1后的BV-2細(xì)胞,收集上清孵育SH-SY5Y細(xì)胞,細(xì)胞活性較未敲低組進(jìn)一步降低、死亡率進(jìn)一步增高,說明Regnase-1調(diào)控了HMGB1介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性作用,論證了Regnase-1在HMGB1介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過程中具有神經(jīng)保護(hù)的潛力。
【關(guān)鍵詞】：調(diào)節(jié)性RNA酶-1 高遷移率蛋白B-1 小膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)炎癥 神經(jīng)保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-26
• 1. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)性疾病20-21
• 2. 高遷移率族蛋白B1與炎癥反應(yīng)21-23
• 3. 調(diào)節(jié)性RNA酶1與炎癥反應(yīng)23-25
• 4. 研究?jī)?nèi)容及研究目的25-26
• 材料與方法26-41
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器26-30
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法30-40
• 3. 統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 結(jié)果41-51
• 1. HMGB1誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)增加41-42
• 2. HMGB1誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的Regnase-1表達(dá)增加42-44
• 3. HMGB1誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)Regnase-1表達(dá)增加并與小膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位44-47
• 4. HMGB1刺激下,敲低BV-2細(xì)胞的Regnase-1使炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步增加47-49
• 5. HMGB1刺激下,敲低Regnase-1的表達(dá)增加BV-2細(xì)胞上清的神經(jīng)元毒性49-51
• 討論51-58
• 1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性51-52
• 2. 有關(guān)HMGB1介導(dǎo)炎性過程的負(fù)性調(diào)控機(jī)制52-56
• 3. Regnase-1的炎性調(diào)控作用及誘導(dǎo)其表達(dá)的信號(hào)通路56-58
• 局限性與展望58-60
• 全文總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 中英文縮寫詞對(duì)照表69-71
• 攻讀學(xué)位期間成果71-72
• 致謝72-74

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本文編號(hào)：584061