本文關(guān)鍵詞：下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)—結(jié)節(jié)乳頭體核對(duì)大鼠睡眠—覺醒周期的調(diào)節(jié)作用及其受體途徑研究

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【摘要】：目的下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)和結(jié)節(jié)乳頭體核(tuberomammillary nucleus,TMN)分別是公認(rèn)的促睡眠中樞和促覺醒中樞,兩者以“此消彼長(zhǎng)”相互制約的模式進(jìn)行睡眠覺醒周期的調(diào)控。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是腦內(nèi)參與睡眠覺醒調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。為了進(jìn)一步探究和闡述下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)-結(jié)節(jié)乳頭體核調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過多導(dǎo)睡眠描記技術(shù)、腦立體定位微量注射技術(shù)、免疫組織化學(xué)等方法探討VLPO-TMN對(duì)大鼠睡眠-覺醒周期的影響及其調(diào)節(jié)的受體通路。方法1.動(dòng)物分組:根據(jù)實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì),大鼠用于三個(gè)部分:1.1多導(dǎo)睡眠描記與分析:大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組[VLPO和TMN內(nèi)均微量注射人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF),即VLPO+ACSFTMN+ACSF組]和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(VLPO微量注射L-Glu同時(shí)TMN微量注射ACSF,即VLPO+L-GluTMN+ACSF組)、實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(VLPO微量注射L-Glu同時(shí)TMN微量注射Bic,即VLPO+L-GluTMN+Bic組)。1.2檢測(cè)VLPO區(qū)域代謝型谷氨酸受體以及TMN核團(tuán)GABAA受體表達(dá)。1.3觀察興奮VLPO神經(jīng)元后TMN區(qū)域c-Fos表達(dá)量的變化:大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(VLPO微量注射ACSF,即VLPO+ACSF組)和實(shí)驗(yàn)組(VLPO微量注射L-Glu,即VLPO+L-Glu組)。術(shù)前準(zhǔn)備好所需試劑以及儀器設(shè)備。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后將其頭部固定于腦立體定位儀上,暴露顱骨,根據(jù)大鼠腦定位圖譜把兩根不銹鋼中空引導(dǎo)管插入VLPO(AP:-0.36 mm;R:1.30 mm;H:-7.00 mm)及TMN(AP:-3.96 mm;R:1.50mm;H:-7.70mm)用于核團(tuán)內(nèi)給藥,用牙科粘固粉將中空引導(dǎo)管和記錄電極固定于大鼠顱骨表面,再把引導(dǎo)腦電與肌電的電極用細(xì)銅線和微型插座相連接(上述操作步驟用于建立多導(dǎo)睡眠描記模型,觀察大鼠c-Fos表達(dá)變化的大鼠模型建立只需向VLPO內(nèi)插入一根不銹鋼中空引導(dǎo)管用于微量給藥,同時(shí)省去上述電極與微型插座的操作),然后給予大鼠一定劑量抗生素(青霉素),縫合創(chuàng)口,最后放入隔音室中飼養(yǎng),保證飲水和食物充足,并隨時(shí)觀察大鼠恢復(fù)狀況。2.動(dòng)物模型建立選取健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠,體重280-300 g。手3.微量注射給藥用Hamilton微量注射器通過中空引導(dǎo)管向目的核團(tuán)VLPO/TMN注射藥物或ACSF,注射速度為1ml/min,給藥完成將注射器停留1min防止藥液滲出。給藥時(shí)間為22:00-22:20(睡眠描記)和20:00-20:20(c-Fos表達(dá)量變化觀察)。4.多導(dǎo)睡眠描記分析數(shù)據(jù)記錄從給藥前2小時(shí)(20:00)開始,記錄時(shí)間為24小時(shí)。10秒為一個(gè)分段周期,將大鼠的睡眠覺醒周期分成:(1)覺醒期(wakefulness,W);(2)快動(dòng)眼睡眠期(rapid eye movement,REM);(3)非快動(dòng)眼睡眠期(non-rapid eye movement,NREM);REM睡眠和NREM睡眠總和定為總睡眠時(shí)間(total sleep time,TST)。5.取材大鼠經(jīng)腹腔麻醉后,剪開胸腔并暴露心臟,持灌流針從心尖插入心臟經(jīng)左心室至主動(dòng)脈,迅速剪開右心耳,快速注入生理鹽水約250ml,看到肝臟發(fā)白,再緩慢注入4%多聚甲醛約600ml,隨后斷頭并用止血鉗小心撥開顱骨取出腦組織。用刀片切成0.5cm左右厚度,最后放入4%多聚甲醛固定6h。6.免疫組化檢測(cè)將包含目的核團(tuán)的蠟塊切成厚度為4um的切片,烤片后用二甲苯脫蠟梯度酒精水化,使用免疫組化試劑盒進(jìn)行受體染色,最后在顯微鏡下觀察染色情況。7.半定量分析TMN區(qū)域的c-Fos染色用累計(jì)光密度(integrated optical density,IOD)值反映蛋白表達(dá)水平。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(`x±s)表示,組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)以及t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.VLPO微量注射ACSF/L-Glu與TMN微量注射ACSF/Bic對(duì)大鼠腦電活動(dòng)的影響1.1與對(duì)照組VLPO+ACSFTMN+ACSF組(n=8)相比,VLPO+L-GluTMN+ACSF組(n=7)大鼠VLPO內(nèi)微量注射L-Glu后從第二個(gè)小時(shí)起的兩個(gè)小時(shí)內(nèi),其覺醒減少42.2%(38.13±3.17,P0.01),非快動(dòng)眼睡眠(NREM)與總睡眠時(shí)間(TST)分別增加了89.5%(52.90±2.98,P0.01)、80.5%(69.33±3.63,P0.01),快動(dòng)眼睡眠(REM)無(wú)顯著變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1.2與VLPO+L-GluTMN+ACSF組(n=7)相比,VLPO+L-GluTMN+Bic組(n=8)中GABA受體阻斷劑Bic和L-Glu分別相繼微量注射于TMN和VLPO,給藥后的第二、三個(gè)小時(shí)內(nèi)大鼠的覺醒量增加了81.1%(66.12±3.26,P0.01),REM睡眠和NREM睡眠以及TST分別減少了58.9%(4.94±1.02,P0.05)、50.2%(39.62±2.93,P0.01)、56.1%(47.11±4.14,P0.01)。1.3與VLPO+ACSFTMN+ACSF組比較,VLPO+L-GluTMN+Bic組的大鼠睡眠覺醒狀況未發(fā)生顯著變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.免疫組化結(jié)果2.1 m Glu R5在VLPO區(qū)域的表達(dá)與用PBS代替一抗的空白對(duì)照相比,m Glu R5在VLPO區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)明顯,呈現(xiàn)棕黃色的強(qiáng)染色,定位于胞質(zhì)膜,核呈藍(lán)色,細(xì)胞容易辨認(rèn),結(jié)構(gòu)清晰,陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)良好。2.2 GABAARβ1在TMN區(qū)域的表達(dá)與用PBS代替一抗的空白對(duì)照相比,TMN區(qū)域的GABAARβ1為棕色或棕黃色陽(yáng)性表達(dá),定位于細(xì)胞膜,核呈藍(lán)色,細(xì)胞容易辨認(rèn),結(jié)構(gòu)清晰,陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)良好。3.激動(dòng)VLPO后TMN區(qū)域c-Fos蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組(53.98±2.02)相比,在VLPO腦區(qū)微量注射L-Glu后,檢測(cè)到大鼠的TMN區(qū)域c-Fos表達(dá)量(21.82±1.22)明顯減少,IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,軟件分析t=11.10(P0.01)。結(jié)論存在于VLPO和TMN的代謝型谷氨酸受體及γ-氨基丁酸受體介導(dǎo)VLPO-TMN的通路調(diào)節(jié),VLPO可通過GABAAR抑制TMN神經(jīng)元活動(dòng)。
【關(guān)鍵詞】：下丘腦腹外側(cè)視前區(qū) 結(jié)節(jié)乳頭體核 c-Fos 免疫組織化學(xué)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R740
【目錄】：

• 英文縮略詞對(duì)照表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-28
• 結(jié)果28-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-45
• 附錄45-46
• 致謝46-47
• 綜述47-60
• 參考文獻(xiàn)53-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 丁丁;丁睿;吳芳;張瑾;許奇;解敏;王烈成;;大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)和結(jié)節(jié)乳頭體核的直接神經(jīng)纖維投射研究[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年10期

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本文編號(hào)：561982