本文關鍵詞：仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的骨組織工程研究

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【摘要】：背景：骨的損傷和缺損是一個十分嚴重的健康問題,已經導致了全球每年成千上萬的手術量,特別是復雜因素所致的損傷和畸形、骨質疏松和腫瘤所致的病理性骨折。自體骨、同種異體骨和各種各樣的人工材料例如：高分子、無機非金屬材料、金屬材料和它們的混合物,已經在骨修復或者替代中得到了運用。然而,沒有一種材料可以即經濟又有效的滿足患者的治療需要。作為一門交叉學科,骨組織工程近些年來得到了長足發(fā)展。骨組織工程材料能夠模仿天然骨的結構、力學和生物學特性。因此新型的、細胞相容性良好的骨組織工程材料在提高臨床治療方面被寄予厚望。骨組織工程三要素：支架材料、細胞和生長因子,其中支架材料是尤為重要的。模擬骨組織的結構和組成的材料,即仿生材料,從過去到現在的數十年間被廣泛研究。仿生材料著眼于為細胞增殖和分化提供一個三維立體(Three Dimensional,3D)環(huán)境。一個良好的3D的環(huán)境能夠增強細胞與細胞之間的聯系、細胞和基質材料的相互作用、促進可溶性分子信號擴散、營養(yǎng)的輸注和代謝廢物的移除。骨組織由細胞外基質和細胞構成,而骨的細胞外基質主要由Ⅰ型膠原構成,是礦物沉積、骨傳導和骨誘導的基礎。明膠是由一種膠原蛋白水解產生的蛋白質,與細胞外基質的分子組成基本一致。多年以來,明膠水凝膠由于具有低廉的價格、可生物降解性、優(yōu)良的生物相容性以及易修飾性等一系列優(yōu)點,已引起大家的廣泛關注,并積累了與其有關的眾多研究經驗。其中,明膠甲基丙烯酰胺(Gelatin Methacrylamide, GelMA)是一種可以很好地模擬天然細胞外基質(Extracellular Matrix, ECM)物理化學性質的理想替代材料。甲基丙烯酸鹽基團接枝到明膠側鏈的氨基上,然后通過化學交聯獲得GelMA。化學交聯后的GelMA可以在正常體溫(37℃)條件下維持穩(wěn)定,能夠增強細胞活力和限制細胞的伸展等,目前已經在軟骨修復、功能血管網的生成等方面對它進行了研究。然而,到目前為止沒有任何研究團隊和組織將其運用至骨再生研究中�？赡苁瞧涔饣目妆谂c天然骨形貌不符等因素限制了GelMA在骨再生中的運用。近年來,脂肪來源的干細胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs)作為骨組織工程的種子細胞引起了研究者們極大的關注。研究表明ADSCs的許多功能與骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)類似,然而,ADSCs與BMSCs相比有幾點優(yōu)勢：來源廣泛,容易獲得；供者不良反應低；較好的成骨成血管性能。而且,有研究報道,體外條件下脫細胞同種異體骨可以促進ADSCs的成骨分化。近期研究報道ADSCs種植于納米生物陶瓷表面能夠促進其成骨分化。本研究的目的在于合成一種仿生GelMA(Biomimetic GelMA,Bio-GelMA)支架,并且此支架材料能夠促進ADSCs的增殖和分化,最終實現骨缺損修復替代的功能。簡言之,本研究主要由三個階段組成。首先,通過熱致相分離技術(Thermally Induced Phase Separation TIPS),制造出粗糙表面和多孔側壁形貌的Bio-GelMA;其次,將ADSCs種植于仿生GelMA支架上誘導成骨分化,研究體外成骨效果；最后,運用裸鼠皮下種植和大鼠顱骨缺損動物模型研究其體內成骨效果。我們的研究內容主要包括如下三個章節(jié)第一章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的合成及表征[目的]通過熱致相分離技術(TIPS),制造出粗糙表面和多孔側壁形貌的Bio-GelMA。[方法]GelMA的合成方法：將10%(w/v)明膠溶于50℃雙蒸水中,攪拌直至完全溶解。將甲基丙烯酸酐加入明膠溶液體系內,讓其在50℃反應條件下反應3小時。隨后,在混合物透析袋內透析并用中性濾紙過濾。最后,過濾后的GelMA溶液放入-80℃冷凍,冷凍干燥,并存儲于室溫下待用。通過1H NMR評價接枝反應。TIPS技術合成3D的GelMA支架：首先,將冷凍干燥的GelMA(1.25g)溶于25m1,40℃雙蒸水中,并加入引發(fā)劑：1%(w/v)過硫酸銨(APS)及0.2%(v/v)N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED);隨后,依次將混合物放入-20℃,12小時和-80℃,48小時冷凍。交聯成膠后,用自制打孔器裁剪成大小一致的樣品(長10mm,寬8mm,厚度大約1.5mm)；然后,使用冰凍切片機切除材料的表皮；最后,冷凍干燥。使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察冷凍干燥的水凝膠支架的形貌。[結果]明膠甲基丙烯酰胺的核磁共振波譜顯示在5.3ppm和5.6ppm處有波峰,即丙烯酰胺雙鍵波峰所在位置,丙烯酰胺基團取代率為53%。支架材料的SEM觀察結果：Bio-GelMA支架具有低密度、高孔隙率和空隙互相連通的特點。通過Image J軟件計算Bio-GelMA的孔隙率為85%。Bio-GelMA支架的孔徑大約100～500 nm。更重要的是,與傳統GelMA支架光滑的側壁相比,Bio-GelMA支架材料的側壁含有很多孔隙,互相交通的孔隙及粗糙的側壁。而且,與傳統GelMA支架相比較Bio-GelMA支架材料少了一層薄薄的表皮(上下底面),[結論]我們利用熱致相分離技術(TIPS)合成了物理結構和化學組成類似于天然骨ECM的支架。第二章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復合ADSCs的體外成骨研究[目的]研究仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架與ADSCs共培養(yǎng)并誘導成骨分化的情況。觀察ADSCs種植于材料后的不同時間點生物相容性、堿性磷酸酶活性、鈣鹽沉積量、基因表達水平的變化趨勢等評價指標。[方法]ADSCs細胞種植于材料,成骨誘導第7,14,21天后評價其活力。激發(fā)／發(fā)射濾片設定為488/530nm觀察活細胞(綠色),設定為530/580 nm觀察死細胞(紅色)。每個時間點選取6個樣本,使用Image J軟件計算活細胞和死細胞的數量。把ADSCs分為兩組,分別種植于材料或種植于培養(yǎng)皿中,并加入成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7,14和21天后,首先用PBS洗滌各組樣品三次；隨后,將種植于60mm細胞培養(yǎng)皿中的ADSCs于冰上加入Lysis Buffer裂解,而種植于材料上的ADSCs直接加入Lysis Buffer后用勻漿器研磨。按照說明書步驟(堿性磷酸酶檢測試劑盒)使用酶標儀,在405nm處測試吸光度。茜素紅染色(ARS)能夠定性定量評價分析成骨細胞的鈣鹽沉積。ADSCs種植于材料或者種植于培養(yǎng)皿中并用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7,14和21天后,樣品首先依次用PBS洗滌三次,4%多聚甲醛固定1小時；然后D-PBS洗滌2次,室溫下0.1%ARS染色15分鐘；隨后,用D-PBS洗去ARS,在倒置顯微鏡下觀察照片。為了定量分析鈣鹽沉積,樣品再次加入100mM氯化十六烷基吡啶反應30分鐘。收集染色液,使用酶標儀在562nm測吸光度。我們通過RT-PCR來評價重要的骨相關的基因表達水平：使用RNA提取試劑盒分離和純化總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒,加入逆轉錄酶使1mgRNA合成第一鏈cDNA.樣品一式三份,使用ABI StepOne Plus系統進行RT-PCR。[結果]我們觀察到材料內有許多ADSCs,且ADSCs在材料表面長勢良好。隨著時間的推移,ADSCs與支架材料聯系越來越緊密,并且,ADSCs牢牢地附著在材料的孔洞骨架上,并可以沿著材料的側壁走形成列生長。第14和21天的ALP活性定量分析結果提示材料上種植的細胞的ALP活性明顯比對照組的高(p0.01),而第7天結果無統計學差異。此外,21天較14天的ALP量增加了近一倍。而且隨著時間的推移,材料上種植的ADSCs的ALP活性逐漸增加,但對照組則降低。隨著時間的推移,材料上種植的ADSCs組較無材料種植ADSCs組(對照組)鈣鹽沉積量明顯增加且隨著時間的推移鈣鹽沿著支架側壁沉積。更重要的是,鈣鹽沉積的定量分析也驗證了這一結果。第7天,材料種植ADSCs組的ALP,BSP,OCN,ColI和OPN基因表達較對照組減低,而OSX和RUX2表達量則增加。而且,第14天和21天的ALP, OSX,OCN和RUX2基因表達結果無統計學差異。第21天的BSP基因表達則下調,而14天的結果則上調。第14天的ColI和OPN的基因表達也下調,而21天的結果則上調。[結論]在體外條件下,仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架材料能夠促進大鼠ADSCs細胞的粘附、伸展、增殖和成骨分化。第三章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復合ADSCs的體內成骨研究[目的]研究仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復合ADSCs種植于動物體內的成骨表現。觀察ADSCs種植于材料后植入裸鼠皮下異位成骨效果及大鼠顱骨缺損部位修復效果。[方法]每只裸鼠制造2個皮下口袋,分別種植兩種材料：一側為未種植細胞的水凝膠(對照組),另一側為種植細胞的水凝膠(實驗組),兩種材料在種植前均先在成骨誘導培養(yǎng)基孵育21天,。種植材料4周后,處死裸鼠取出植入物。將植入物固定、脫鈣5天,梯度脫水,石蠟包埋,切片并HE染色。將其它的植入物冰凍切片,然后進行HE染色及免疫熒光檢測,目的基因包括：RUX2,collagen 1, osteocalcin和osteopontin。隨機選取成年雄性SD大鼠(n=7,200-300g)用乙醚及10%水合氯醛(3.3 ml/kg)麻醉,剪去手術區(qū)域毛發(fā)并用碘伏消毒。切開頭皮并剝離覆蓋顱骨表面的骨膜暴露顱骨。使用環(huán)鉆小心地在顱骨兩側進行鉆孔(注意保護硬腦膜,以免誤傷),制作大小為直徑5mm的圓形顱骨缺損。備好兩組材料：一組為未種植細胞的水凝膠(對照組),另一組為種植細胞的水凝膠(實驗組),兩種材料在種植前均先在成骨誘導培養(yǎng)基孵育21天。將兩種材料分別植入同一大鼠左右兩個顱骨缺損部位。最后縫合皮膚。植入植入物12周后,處死大鼠。切取顱蓋骨并修整,使用Micro-CT評價樣品,掃描層薄24 μ m。使用mimics軟件三維重建圖像,并研究來自于每組7個樣品的重建圖像。樣品Micro-CT掃描后,使用Perenyi's溶液脫鈣7天,梯度脫水,石蠟包埋,切片,HE染色及Masson染色,顯微鏡觀察拍照。[結果]植入物植入4周后的HE染色結果顯示：種植ADSCs材料組(實驗組)的支架上可以看到一些成骨細胞集團,分散在大量纖維結締組織中間。值得注意的是在支架上可以觀察到成骨細胞甚至破骨細胞。相反的,未種植ADSCs的材料組(對照組)的纖維結締組織包裹了材料,但是數量明顯較少且未見類骨細胞出現。免疫熒光染色示：與對照組相比,實驗組的COL I,OCN,OPN和RUX2表達量明顯增加。Micro-CT分析示：通過與空白組骨體積的實驗數據相減的方法,獲得新生骨的實驗數據,實驗組較對照組的骨形成有明顯增加,。HE染色和Masson's三染色結果也都提示實驗組較對照組的骨形成有明顯增加。另外,新骨組織在材料周圍含有大量的骨細胞。[結論]在異位成骨實驗中,發(fā)現持續(xù)的大量成骨組織形成及成骨相關蛋白高表達,但是沒有發(fā)現異位骨的形成。而且,我們不能判定成骨細胞的來源,是ADSCs還是裸鼠自身細胞。盡管如此,我們的研究證實了支架材料能夠促進細胞分化。令人高興的是,在顱骨缺損修復實驗中,ADSCs復合材料組(實驗組)結果證實了有新骨形成,提示ADSCs復合明膠甲基丙烯酰胺水凝膠材料可能可以作為骨組織工程良好材料。
【關鍵詞】：骨組織工程 仿生 明膠甲基丙烯酰胺 水凝膠 細胞外基質 3D支架
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-23
• 第一章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的合成及表征23-30
• 1.1 材料和方法23-25
• 1.2 結果25-28
• 1.3 討論28-29
• 1.4 結論29-30
• 第二章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復合ADSCs的體外成骨研究30-46
• 2.1 材料與方法30-41
• 2.2 結果41-44
• 2.3 討論44-45
• 2.4 結論45-46
• 第三章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復合ADSCs的體內成骨研究46-58
• 3.1 材料與方法46-53
• 3.2 結果53-57
• 3.3 討論57
• 3.4 結論57-58
• 參考文獻58-63
• 全文小結63-64
• 中英文對照縮略詞表64-65
• 成果65-66
• 致謝66-69

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