本文關(guān)鍵詞：仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的骨組織工程研究

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【摘要】：背景：骨的損傷和缺損是一個(gè)十分嚴(yán)重的健康問題,已經(jīng)導(dǎo)致了全球每年成千上萬的手術(shù)量,特別是復(fù)雜因素所致的損傷和畸形、骨質(zhì)疏松和腫瘤所致的病理性骨折。自體骨、同種異體骨和各種各樣的人工材料例如：高分子、無機(jī)非金屬材料、金屬材料和它們的混合物,已經(jīng)在骨修復(fù)或者替代中得到了運(yùn)用。然而,沒有一種材料可以即經(jīng)濟(jì)又有效的滿足患者的治療需要。作為一門交叉學(xué)科,骨組織工程近些年來得到了長足發(fā)展。骨組織工程材料能夠模仿天然骨的結(jié)構(gòu)、力學(xué)和生物學(xué)特性。因此新型的、細(xì)胞相容性良好的骨組織工程材料在提高臨床治療方面被寄予厚望。骨組織工程三要素：支架材料、細(xì)胞和生長因子,其中支架材料是尤為重要的。模擬骨組織的結(jié)構(gòu)和組成的材料,即仿生材料,從過去到現(xiàn)在的數(shù)十年間被廣泛研究。仿生材料著眼于為細(xì)胞增殖和分化提供一個(gè)三維立體(Three Dimensional,3D)環(huán)境。一個(gè)良好的3D的環(huán)境能夠增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系、細(xì)胞和基質(zhì)材料的相互作用、促進(jìn)可溶性分子信號擴(kuò)散、營養(yǎng)的輸注和代謝廢物的移除。骨組織由細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞構(gòu)成,而骨的細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型膠原構(gòu)成,是礦物沉積、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的基礎(chǔ)。明膠是由一種膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì),與細(xì)胞外基質(zhì)的分子組成基本一致。多年以來,明膠水凝膠由于具有低廉的價(jià)格、可生物降解性、優(yōu)良的生物相容性以及易修飾性等一系列優(yōu)點(diǎn),已引起大家的廣泛關(guān)注,并積累了與其有關(guān)的眾多研究經(jīng)驗(yàn)。其中,明膠甲基丙烯酰胺(Gelatin Methacrylamide, GelMA)是一種可以很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)物理化學(xué)性質(zhì)的理想替代材料。甲基丙烯酸鹽基團(tuán)接枝到明膠側(cè)鏈的氨基上,然后通過化學(xué)交聯(lián)獲得GelMA。化學(xué)交聯(lián)后的GelMA可以在正常體溫(37℃)條件下維持穩(wěn)定,能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力和限制細(xì)胞的伸展等,目前已經(jīng)在軟骨修復(fù)、功能血管網(wǎng)的生成等方面對它進(jìn)行了研究。然而,到目前為止沒有任何研究團(tuán)隊(duì)和組織將其運(yùn)用至骨再生研究中。可能是其光滑的孔壁與天然骨形貌不符等因素限制了GelMA在骨再生中的運(yùn)用。近年來,脂肪來源的干細(xì)胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs)作為骨組織工程的種子細(xì)胞引起了研究者們極大的關(guān)注。研究表明ADSCs的許多功能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)類似,然而,ADSCs與BMSCs相比有幾點(diǎn)優(yōu)勢：來源廣泛,容易獲得；供者不良反應(yīng)低；較好的成骨成血管性能。而且,有研究報(bào)道,體外條件下脫細(xì)胞同種異體骨可以促進(jìn)ADSCs的成骨分化。近期研究報(bào)道ADSCs種植于納米生物陶瓷表面能夠促進(jìn)其成骨分化。本研究的目的在于合成一種仿生GelMA(Biomimetic GelMA,Bio-GelMA)支架,并且此支架材料能夠促進(jìn)ADSCs的增殖和分化,最終實(shí)現(xiàn)骨缺損修復(fù)替代的功能。簡言之,本研究主要由三個(gè)階段組成。首先,通過熱致相分離技術(shù)(Thermally Induced Phase Separation TIPS),制造出粗糙表面和多孔側(cè)壁形貌的Bio-GelMA;其次,將ADSCs種植于仿生GelMA支架上誘導(dǎo)成骨分化,研究體外成骨效果；最后,運(yùn)用裸鼠皮下種植和大鼠顱骨缺損動(dòng)物模型研究其體內(nèi)成骨效果。我們的研究內(nèi)容主要包括如下三個(gè)章節(jié)第一章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的合成及表征[目的]通過熱致相分離技術(shù)(TIPS),制造出粗糙表面和多孔側(cè)壁形貌的Bio-GelMA。[方法]GelMA的合成方法：將10%(w/v)明膠溶于50℃雙蒸水中,攪拌直至完全溶解。將甲基丙烯酸酐加入明膠溶液體系內(nèi),讓其在50℃反應(yīng)條件下反應(yīng)3小時(shí)。隨后,在混合物透析袋內(nèi)透析并用中性濾紙過濾。最后,過濾后的GelMA溶液放入-80℃冷凍,冷凍干燥,并存儲(chǔ)于室溫下待用。通過1H NMR評價(jià)接枝反應(yīng)。TIPS技術(shù)合成3D的GelMA支架：首先,將冷凍干燥的GelMA(1.25g)溶于25m1,40℃雙蒸水中,并加入引發(fā)劑：1%(w/v)過硫酸銨(APS)及0.2%(v/v)N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED);隨后,依次將混合物放入-20℃,12小時(shí)和-80℃,48小時(shí)冷凍。交聯(lián)成膠后,用自制打孔器裁剪成大小一致的樣品(長10mm,寬8mm,厚度大約1.5mm)；然后,使用冰凍切片機(jī)切除材料的表皮；最后,冷凍干燥。使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察冷凍干燥的水凝膠支架的形貌。[結(jié)果]明膠甲基丙烯酰胺的核磁共振波譜顯示在5.3ppm和5.6ppm處有波峰,即丙烯酰胺雙鍵波峰所在位置,丙烯酰胺基團(tuán)取代率為53%。支架材料的SEM觀察結(jié)果：Bio-GelMA支架具有低密度、高孔隙率和空隙互相連通的特點(diǎn)。通過Image J軟件計(jì)算Bio-GelMA的孔隙率為85%。Bio-GelMA支架的孔徑大約100～500 nm。更重要的是,與傳統(tǒng)GelMA支架光滑的側(cè)壁相比,Bio-GelMA支架材料的側(cè)壁含有很多孔隙,互相交通的孔隙及粗糙的側(cè)壁。而且,與傳統(tǒng)GelMA支架相比較Bio-GelMA支架材料少了一層薄薄的表皮(上下底面),[結(jié)論]我們利用熱致相分離技術(shù)(TIPS)合成了物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成類似于天然骨ECM的支架。第二章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復(fù)合ADSCs的體外成骨研究[目的]研究仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架與ADSCs共培養(yǎng)并誘導(dǎo)成骨分化的情況。觀察ADSCs種植于材料后的不同時(shí)間點(diǎn)生物相容性、堿性磷酸酶活性、鈣鹽沉積量、基因表達(dá)水平的變化趨勢等評價(jià)指標(biāo)。[方法]ADSCs細(xì)胞種植于材料,成骨誘導(dǎo)第7,14,21天后評價(jià)其活力。激發(fā)／發(fā)射濾片設(shè)定為488/530nm觀察活細(xì)胞(綠色),設(shè)定為530/580 nm觀察死細(xì)胞(紅色)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取6個(gè)樣本,使用Image J軟件計(jì)算活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量。把ADSCs分為兩組,分別種植于材料或種植于培養(yǎng)皿中,并加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7,14和21天后,首先用PBS洗滌各組樣品三次；隨后,將種植于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的ADSCs于冰上加入Lysis Buffer裂解,而種植于材料上的ADSCs直接加入Lysis Buffer后用勻漿器研磨。按照說明書步驟(堿性磷酸酶檢測試劑盒)使用酶標(biāo)儀,在405nm處測試吸光度。茜素紅染色(ARS)能夠定性定量評價(jià)分析成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積。ADSCs種植于材料或者種植于培養(yǎng)皿中并用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7,14和21天后,樣品首先依次用PBS洗滌三次,4%多聚甲醛固定1小時(shí)；然后D-PBS洗滌2次,室溫下0.1%ARS染色15分鐘；隨后,用D-PBS洗去ARS,在倒置顯微鏡下觀察照片。為了定量分析鈣鹽沉積,樣品再次加入100mM氯化十六烷基吡啶反應(yīng)30分鐘。收集染色液,使用酶標(biāo)儀在562nm測吸光度。我們通過RT-PCR來評價(jià)重要的骨相關(guān)的基因表達(dá)水平：使用RNA提取試劑盒分離和純化總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒,加入逆轉(zhuǎn)錄酶使1mgRNA合成第一鏈cDNA.樣品一式三份,使用ABI StepOne Plus系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。[結(jié)果]我們觀察到材料內(nèi)有許多ADSCs,且ADSCs在材料表面長勢良好。隨著時(shí)間的推移,ADSCs與支架材料聯(lián)系越來越緊密,并且,ADSCs牢牢地附著在材料的孔洞骨架上,并可以沿著材料的側(cè)壁走形成列生長。第14和21天的ALP活性定量分析結(jié)果提示材料上種植的細(xì)胞的ALP活性明顯比對照組的高(p0.01),而第7天結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,21天較14天的ALP量增加了近一倍。而且隨著時(shí)間的推移,材料上種植的ADSCs的ALP活性逐漸增加,但對照組則降低。隨著時(shí)間的推移,材料上種植的ADSCs組較無材料種植ADSCs組(對照組)鈣鹽沉積量明顯增加且隨著時(shí)間的推移鈣鹽沿著支架側(cè)壁沉積。更重要的是,鈣鹽沉積的定量分析也驗(yàn)證了這一結(jié)果。第7天,材料種植ADSCs組的ALP,BSP,OCN,ColI和OPN基因表達(dá)較對照組減低,而OSX和RUX2表達(dá)量則增加。而且,第14天和21天的ALP, OSX,OCN和RUX2基因表達(dá)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第21天的BSP基因表達(dá)則下調(diào),而14天的結(jié)果則上調(diào)。第14天的ColI和OPN的基因表達(dá)也下調(diào),而21天的結(jié)果則上調(diào)。[結(jié)論]在體外條件下,仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架材料能夠促進(jìn)大鼠ADSCs細(xì)胞的粘附、伸展、增殖和成骨分化。第三章仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復(fù)合ADSCs的體內(nèi)成骨研究[目的]研究仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復(fù)合ADSCs種植于動(dòng)物體內(nèi)的成骨表現(xiàn)。觀察ADSCs種植于材料后植入裸鼠皮下異位成骨效果及大鼠顱骨缺損部位修復(fù)效果。[方法]每只裸鼠制造2個(gè)皮下口袋,分別種植兩種材料：一側(cè)為未種植細(xì)胞的水凝膠(對照組),另一側(cè)為種植細(xì)胞的水凝膠(實(shí)驗(yàn)組),兩種材料在種植前均先在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基孵育21天,。種植材料4周后,處死裸鼠取出植入物。將植入物固定、脫鈣5天,梯度脫水,石蠟包埋,切片并HE染色。將其它的植入物冰凍切片,然后進(jìn)行HE染色及免疫熒光檢測,目的基因包括：RUX2,collagen 1, osteocalcin和osteopontin。隨機(jī)選取成年雄性SD大鼠(n=7,200-300g)用乙醚及10%水合氯醛(3.3 ml/kg)麻醉,剪去手術(shù)區(qū)域毛發(fā)并用碘伏消毒。切開頭皮并剝離覆蓋顱骨表面的骨膜暴露顱骨。使用環(huán)鉆小心地在顱骨兩側(cè)進(jìn)行鉆孔(注意保護(hù)硬腦膜,以免誤傷),制作大小為直徑5mm的圓形顱骨缺損。備好兩組材料：一組為未種植細(xì)胞的水凝膠(對照組),另一組為種植細(xì)胞的水凝膠(實(shí)驗(yàn)組),兩種材料在種植前均先在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基孵育21天。將兩種材料分別植入同一大鼠左右兩個(gè)顱骨缺損部位。最后縫合皮膚。植入植入物12周后,處死大鼠。切取顱蓋骨并修整,使用Micro-CT評價(jià)樣品,掃描層薄24 μ m。使用mimics軟件三維重建圖像,并研究來自于每組7個(gè)樣品的重建圖像。樣品Micro-CT掃描后,使用Perenyi's溶液脫鈣7天,梯度脫水,石蠟包埋,切片,HE染色及Masson染色,顯微鏡觀察拍照。[結(jié)果]植入物植入4周后的HE染色結(jié)果顯示：種植ADSCs材料組(實(shí)驗(yàn)組)的支架上可以看到一些成骨細(xì)胞集團(tuán),分散在大量纖維結(jié)締組織中間。值得注意的是在支架上可以觀察到成骨細(xì)胞甚至破骨細(xì)胞。相反的,未種植ADSCs的材料組(對照組)的纖維結(jié)締組織包裹了材料,但是數(shù)量明顯較少且未見類骨細(xì)胞出現(xiàn)。免疫熒光染色示：與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的COL I,OCN,OPN和RUX2表達(dá)量明顯增加。Micro-CT分析示：通過與空白組骨體積的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相減的方法,獲得新生骨的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)組較對照組的骨形成有明顯增加,。HE染色和Masson's三染色結(jié)果也都提示實(shí)驗(yàn)組較對照組的骨形成有明顯增加。另外,新骨組織在材料周圍含有大量的骨細(xì)胞。[結(jié)論]在異位成骨實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)持續(xù)的大量成骨組織形成及成骨相關(guān)蛋白高表達(dá),但是沒有發(fā)現(xiàn)異位骨的形成。而且,我們不能判定成骨細(xì)胞的來源,是ADSCs還是裸鼠自身細(xì)胞。盡管如此,我們的研究證實(shí)了支架材料能夠促進(jìn)細(xì)胞分化。令人高興的是,在顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,ADSCs復(fù)合材料組(實(shí)驗(yàn)組)結(jié)果證實(shí)了有新骨形成,提示ADSCs復(fù)合明膠甲基丙烯酰胺水凝膠材料可能可以作為骨組織工程良好材料。
【關(guān)鍵詞】：骨組織工程 仿生 明膠甲基丙烯酰胺 水凝膠 細(xì)胞外基質(zhì) 3D支架
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-23
• 第一章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架的合成及表征23-30
• 1.1 材料和方法23-25
• 1.2 結(jié)果25-28
• 1.3 討論28-29
• 1.4 結(jié)論29-30
• 第二章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復(fù)合ADSCs的體外成骨研究30-46
• 2.1 材料與方法30-41
• 2.2 結(jié)果41-44
• 2.3 討論44-45
• 2.4 結(jié)論45-46
• 第三章 仿生明膠甲基丙烯酰胺水凝膠支架復(fù)合ADSCs的體內(nèi)成骨研究46-58
• 3.1 材料與方法46-53
• 3.2 結(jié)果53-57
• 3.3 討論57
• 3.4 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 全文小結(jié)63-64
• 中英文對照縮略詞表64-65
• 成果65-66
• 致謝66-69

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1 陳，

本文編號：531075